Способ количественного определения биогенных моноаминов

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(71) Научно-производственное объединение "Биолар" и Латвийский государственный университет им. П.Стучки(56) Авторское свидетельство СССРУ 1282006, кл. С 01 И 33/48, 1984.(54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОГЕНН 1 Х МОНОАМИНОВ(57) Изобретение относится к физикохимическим методам анализа, в частности к потенциометрическому определению микроколичеств моноаминов в Изобретение относится к фиэикохимическим методам анализа, в частности к потенциометрическому определению микроколичества моноаминов вбиологических средах, и может бытьиспользовано для клинического и токсикологического анализа в медицинеи Фармакологии,Цель изобретения - расширениефункциональных воэможностей способа,упрошение и удешевление., Определение общего количества биогенных моноаминов осуществляют припомощи ферментсодержащего препаратав виде желатиновой пленки с моноаминооксидазной (МАО) активностью, при.чем суммарное количество тирамина и ЯО 1518375 А 1(50 4 С 12 Ц/26, Г ; 1 33,48, С 12 И 11/02 биологических средах, и может бытьиспользовано для клинического и токснкологического анализа в медицинеи фармакологии. Цель изобретениярасширение функциональных воэможностей способа, упрощение и удешевление,Определение общего количества биогенных моноамйнов осуществляют при помощи ферментсодержащего препарата вв.де желатиновой пленки с моноаминооксидаэной активностью, причем суммарное количество тирамина и серотонина определяют при помощи ферментсодержащего препарата, обработанногопрофлавином к концентрацией (58)10 "М, а количество серотонинапри помощч ферментсодержащего препарата, обработанного профлавином сконцентрацией (1,0-1,5) 1 О М. серотонина определяют при помощиферментсодержащего препарата, обработанного профлавином с концентрацией4(5-8) О юль/л, а количество серотонина - при помощи ферментсодержащегопреп;.рата, обработанного профлавиномс концентрацией (1-1,5) 10 .моль/л,Изобретение обеспечивает расширение функциональных возможностей способа эа счет воэможности определениятирамина,и серотонина как в сумме,так и избирательно,Способ осуществляют следующимобразом.Ферментсодержащий препарат - желатиновую пленку с МАО активностьюпомещают в сосуд для измерения элек 1518375трода с газовым зазором, добавляютисследуемый раствор, В закрытом сосуде в термостате при перемешиваниипроводят инкубацию. После инкубацииферментсодержащую пленку вынимают,добавляют КС 1, охлаждают, закрываютпробкой с рН-электродом, вводят раствор ИаОН (рН12) для освобожденияаммиака. После установления постоянного потенциометра находят по градуировочной прямой значение концентрациимоноаминов, соответствующее значениюпотенциала.Для определения общего количества моноаминов используют уерментсодержащий препарат с МАО активностьюбез обработки ингибитором.Для определения суммы тирамина исеротонина используют фе ментсодержащий препарат с МАО активностью,обработанный профлавином с концентрацией (5-8) 10 моль/л.Для определения количества серотонина используют ферментсодержащий 25препарат с МАО активностью, обработанный профлавином с концентрацией-репарат для определения моноаминовв биологических жидкостях получаютследующим образом, 0,01 г МАО (моноаминооксидазы) или 2 г гомогецатамитохондрий печени с МАО активностьюрастворяют в 0,05-0,07 М фосфатномбуфере с рН 7,3-7,5 и смешивают с352-77 -ным раствором желатина. Получен"ную смесь выливают на нерастворимуюподложку и высушивают в потоке воздуха. Поверхность полученной пленкиобрабатывают 2-83-ным раствором глутарового альдегида (ГА) в течение3-5 мин, Избыток ГА сливают и промывают водой и фосфатным буферным раствором с РН 7,3-7,5. Далее желатиновую пленку, содержащую МАО, обрабатывают фосфатиым буферным растворомпрофлавина с концентрацией ингибитора (5-8) 10 моль/л или (1,5) 10 моль/л в течение 40-50 мин.Потом избыток раствора сливают,промывают пленку фосфатным буфером нвысушивают в потоке воздуха прикомнатной температуре. Пленки, полученные иэ 0,5 г желатина, обрабатывают 30 кп раствора профлавина.55Активность моноаминооксидаэы,включенной в желатиновые пленки,по разным субстратам: по тирамину - не менее 4,5510 мкмоль/мг белка;по серотонину - не менее 3,7О ф мкмоль/мг белка;по бензиламину - не менее 3,1,АЙ 0мкмоль/мг белка или 1600 Е/гпре парата (условные спектрофотометрические единицы)За условную единицу активностиМАО принимают такое количество фермента, которое обуславливает увеличение оптической плотности при250 нм в 10-миллиметровой кюветепри 25 С на 0,001 ед, за 1 мин,За единицу активности МАО принято такое количество фермента которое э 1 мин ферментативно расщепляетмкмоль субстрата.Желатиновые пленки, обработанныепрофлавином, пригодны для многократного использования, поскольку профлавин является необратимым ингибитором МАО и в условиях испальэования пленок не вымывается в течение всегосрока пригодности, который лимигируется механической сохранностьюпленки. Срок годности пленки 4 мес(при проведении пяти определенийькедневно). В сухом ниде при 410 С ферментативная активность пленки сохраняется в течение 9 мес.Определение общего клличества моноаминоя,П р и м е р 2. Ферментсодержащийпрепарат " жепатиновую пленку с МАОактивностью размером 1 х 1 см - помеща .ог в сосуд для измерений электродас газовым зазором, добавляют 5 мл0,15 моль/л раствора КС 1 и 0,5 кписследуемой крови человека. Измерительный сосуд закрывают, помещаютн термостат при 40 С, включают магнитную мешалку и О мин пропускаютО; без СО . Далее поток перекрываюти герметически закрытый сосуд выдерживают 50 мин при 40 С с интенсивнымперемешиванием. После инкубации ферментсодержащую пленку вынимают, в со: уд добавляют 1,4 г КС 1, охлаждаютосуд до 25 1., закрывают пробкой сосгеклянным рН электродом, на поверхность которого помещена капля 0,21 ного раствора тритона Хв бидистиллированной воде, снова пропускаютОа без СО, а затем через капиллярвводят в реакционную смесь 0,2 мл1 моль,л МаОН (рН ь 12) для полногоосвобождения аммиака. После установ1518375 6рамина и сеоотонина (0,2 мкг/мл крови), соответствующее значению пс -тенциала.П р и м е р 5 Определение ведутаналогично примеру 4, однако применяют ферментсодержащий препаратжелатиновую пленкХ с МАО активностью,обработанную профлавином с концент 1 О рацией 8 1 О 4 моль/л.Находят суммарную концентрациютирамина и серотонина (0,27 мкг/мл).П р и м е р 6. Определение ведутаналогично примеру 4, однако приме 15 няют желатиновую пленку с МАО активностью, обработанную профлавином с-4концентрацией 6,5 О моль/л.Суммарная концентрация тираминаи серотонина 0,27 мкг/мл.П р и м е р 7. И сосуд для измерений электрода с газовым зазором помещают ферментсодержащий препаратжелатиновую пленку с МАО активностью,обработанную ингибитором профлавиномс концентрацией 4,0 10 моль/л, Добавляют 3,5 мл 0,15 ил/л раствораКС 1 и 0,5 мл исследуемой крови человека. Далее проводят ннкубированиеи определение аналогично примеру 2.По градуировочной прямой находятзначение концентрации моноаминов(0,30 мкг/мл), соответствующее значению потенциала. В данном случаерезультат завьппен из-эа недостаточно 35 го ингибирования активных центровМАО, ответственных за дезаминированиебензиламина и, слецовательно, определяется еще и часть бензиламина. 40 45 5055 пения постоянного потенциала (рН)( лф 20 мин) на электроде записываютпоказания потенциометра (рН-метра).По градуировочной прямой находятзначение концентрации общих моноаминов, соответствующее значению потенциала,Для контроля содержания аммонияв крови проводят аналогичный холостой опыт с желатиновой пленкой безфермента.Общее содержание моноаминоврассчитывают как разницу между общим количеством аммиака и фоновымколичеством аммиака в холостой пробе.Общее количество моноаминов вкрови 0,36 мкг/мл крови, Во всехопытах использована кровь одногодонора.П р и м е р 3. Ферментсодержащий препарат - желатиновую пленкус МАО активностью размером 1 х см,использованную в примере 2, - прополаскивают водой и помещают в сосуддля измерения электрода с газовымзазором,добавляют О, 24 мл 5 10 смоль/лраствора бенэнламина, 0,24 мл5 10 моль/л раствора тирамина,0,32 мл 5 10 моль/л серотонина и0,2 мл 5 .10 моль/л фенилэтиламина.Туда же добавляют 3 ил К-фосфатногобуфера рН 7,6. Общий объем реакционной смеси 4,0 мл. Концентрация вреакционной смеси, моль,/л: бензиламин 3.10; тирамин 3 10 ; серотофнин 4 .10 ; фенилэтиламина 2,510Общая концентрация моноаминов вреакционной смеси 12,5 О моль/л.Проведение инкубации и определение аналогично примеру 2,По градуировочной прямой находятобщее количество моноаминов (12,610 моль/л).Определение суммарного количества тирамина и серотонина.П р и м е р 4. ферментсодержащийпрепарат - желатиновую пленку с МАОактивностью, обработанную профлавином с концентрацией 5 10моль/л,помещают в сосуд для измерений электрода с газовым зазором, добавляют3,5 мл 0,15 моль/л раствора КС 1 и0,5 мл исследуемой крови чу овека.Далее проводят все операции аналогично примеру 2.Находят по градуировочной прямойзначение суммарной концентрации тиП р и м е р 8. В сосуд для измерений электрода с газовым зазором помещают ферментсодержащий препарат желатиновую пленку с МАО активностью, обработанную ингибитором профлавином с концентрацией 9,5 10 моль/л, Добавляют 3,5 мл 0,15 моль/л раствора КС 1 и 0,5 мл исследуемой крови человека. Далее проводят инкубирование и определение аналогично примеру 2,По градуировочной прямой находят значение суммарной концентрации моно- аминов (0,24 мкг/мл). В данном случае результат занижен, поскольку завьапенная концентрация ингибитора частично ингибировала уже активные центры МАО, ответственные за дезаминирование тирамина и, следовательно, определяется все количество серотонина и только часть тиранила.15183П р и м е р 9. Ферментсодержащий препарат - пленку с МАО активностью, обработанную профлавином с концентрацией 6 10 моль/л, - помещают в сосуд для измерений электрода с газовым зазором, добавляют 0,32 мп 5 1 Ю моль/л раствора серотонина, 0,24 мл 5 10 моль/л раствора тирамина и 0,24 мл 5 10 моль/л раствора бензиламина. Туда же добавляют 3,2 мпО К-фосфатного, буфера, рН 7,6, Общая концентрация моноамннов в реакционьной смеси 1 10 моль/л (серотонина 4 10 моль/л, тирамина 3 О моль/л,бенэиламина 3 10 моль/л).-7 5Определение аналогично примеру 2.По градуировочной прямой находят значение концентрации суммы тирами на и серотонина (7.10 моль/л), соответствующее значению потенциала.Определение серотонина.П р и м е р 1 О, Ферментсодержащий препарат - желатиновую пленку с МАО активностью, обработанную профлавином с концентрацией 1,3-10 моль/л, - помещают в сосуд для измерения электрода с газовым зазором, добавляют 3,5 мл 0,15 моль/л раствора КС 1 и 0,5 мл исследуемой крови человека. Далее проводят все операции аналогично примеру 2. Находят по градуировочной прямой значение концентрации серотонина (0,15 мкг/мп).П р и м е р 11, Определение ведут аналогично примеру 10 с испольэовани 35 ем желатиновой пленки, обработанной профлавином с концентрацией 1,5 10 моль/л,Находят концентрацию серотонина (О,5 мкг/мп).40П р и м е р 12. Определение ведут аналогично примеру 10 с использованием желатиновой пленки, обработанной профлавином с концентрацией-11,4 10 моль/л. Найденная концентра ция серотонина 0,15 мкг/мп.П р и м е р 13. Ферментсодержащий препарат - пленка с МАО активностью, обработанная профлавином с концентра-, цией 9,0 .10 моль/л. Добавляют 3,5 мп 0,15 моль/л раствора КС 1 и 0,5 мп50 исследуемой крови. Далее осуществляют инкубирование и определение аналогично примеру 2.По градуировочной кривой находят значение концентрации моноамина (0,17 мкг/мп). В данном случае результат концентрации серотонина эавьппен, поскольку концентрация ингибитора профлавина недостаточнадля полного ингибирования активныхцентров МАО, деэаминирующих тирамин,и, следовательно, вместе с серотонином определяется еще и часть тирамина.П р и м е р 14 Ферментсодержащийпрепарат - пленка с МАО активностью,обработанная профлавином с концентрацией 1,6 10 моль/лДобавляют3,5 мл 0,15 моль/л раствора КС 1 и0,5 мл исследуемой крови. Далее осуществляют инкубирование и определение аналогично примеру 2По градуировочной кривой находятзначение концентрации моноамнна(0,15 мкг/мл). Аналогично примерам10-12 определяют все количества серотонина. Следовательно, оптимальнымпрепаратом для определения серотонина является пленка, обработаннаяпрофлавином с концентрацией (1 --з1,5) 10 моль/л. Применение препарата, обработанного увеличенным количеством ингибитора, не требуется иявляется нецелесообразным.П р и м е р 15, Ферментсодержащийпрепарат - пленку с МАО активностью,обработанную профлавином с концентрацией 1,4 10моль/л, - помещаютв сосуд, добавляют 0,24 мл 510моль/л раствора бенэиламина,0,24 мп 5 10моль/л тирамина,0,32 мп 5 1 О моль/л серотоннна. Добазляют 3,2 мл К-фосфатного буферас РН 7,6 для доведения общего абьемареакционной смеси до 5,0.Концентрация серотанина в реакЪционной смеси 4 10 моль/л, Определение аналогично примеру 2.Значение концентрации моноамина,найденное по градуировочной прямой, -4 10 моль/л, что соответствует введенному количеству серотонина,П р и м е р 16. Ферментсодержащийпрепарат - желатиновую пленку с МАОактивностью, обработанную профлавином с концентрацией 1 10 моль/л,помещают в сосуд для измерений электрода с газовым зазором, добавляют3,5 мп 0,15 моль/л раствора КС 1 и0,5 мл исследуемой крови человека,Измерительный сосуд закрывают, помещают в термостат при 40 ОС, включаютмагнитную мешалку и 10 мнн пропускают 02. без СО 2. Далее поток перекрывают и герметически закрытий сосудовыдерживают 50 мин при 40 С с интен1 О 1518 375Значение концентрации серотонина,найденное по градуировочной прямой,4 10 моль/л, что соответствует введенному количествуЧувствительность способа 21 О з моль/л,Интервал линейности калибровочного графика способа 2 10 "- 2 10 моль/л. Формула изобретения. По градуировочной прямой находятзначение концентрации серотонина 20(0,15 мкг/мл), соответствующее значению потенциала,П р и м е р 17. Ферментсодержащийпрепарат - пленку с МАО активностью,обработанню профлавином с концентрацией 1 10 моль/л, - помещают в сосуддля измерений электрода с газовым за,зором, добавляют 0,24 мп 5 10 моль/лбенэиламина, 0,24 мл 5 .10 моль/л тирамина, 0,32 мп 4 .10 моль/л серотонина, 0,2 мл 5 10 моль/л фенилэтиламина. Добавляют 3,0 мп К-фосфатногобуфера с РН 7,6. Концентрация серотонина в реакционной смеси 410 моль/л. Определение аналогичнопримеру 16. Составитель А.СеменовТехред М,Ходанич Корректор Э.Лончакова Редактор М.Петрова Заказ 6568/31 Тираж 501 ПодписноеБНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., л. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент",г,Ужгород, ул. Гагарина,101 сивным перемешиванием. После инкубации ферментсодержащую пленку вынимают, в сосуд добавляют 1,4 г КС 1, охлаждают сосуд до 25 С, закрывают пробкой со стеклянным рН-электродом, наповерхность, которого помещена капля 0,2 Х-ного раствора тритона Х в бидистиллированной воде. Снова пропускают О без СО и затем через 10капилляр вводят в реакционную смесь0,2 мп 1 моль/л МаОН (рН 3 2) дляполного освобождения аммиака. Послеустановления постоянного потенциала (рН) (20 мин) на электроде эаписывают показания потенциаометра(рН-метра)Способ количественного определения биогенных моноаминов путем их дезаминиревания при помощи ферментного препарата с моноаминооксидазной активностью с последующим потенциометрическим определением образовавшегося аммиака при помощи рН-электрода, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью расширения функциональных воэможностей способа, упрощения и уде- шевления, определяют общее количества биогенных аминов при помощи ферментсодержащего препарата, выполненного в виде желатиновой: пленки с моноаминооксидазной активностью, причем суммарное количество тирамина и серотонина определяют при помощи ферментсодержащего препарата, обработанного профлавином с концентрацией (5-8) 10моль, а количество серотонина - при помощи фермент- содержащего препарата, обработанного профлавином с концентрацией (1,0 - 1,5)1 О моль.