Способ получения тимостерина а

-фавъюН. Тихонова, В. П, Вендт и И. О. Трикащ2) Авто зобретеии вого Красного Знамени ннституй бнохнмнм, А. В, Палладнна Ордена вител ОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТИМОСТЕРИНА А 2 олученного экстракта на колонке и элюнроваром атографнейе целевого пронх растворитедукта смесью органнчелей 2 .О ако известный с к Изобретение относится к фармацевтической промышленности и касается производства биологически активных препаратов из сырья животного происхождения,Известен способ получения биологически активных веществ нз тимуса теленка, стимулирующих созревание Т-лнмфоцитов, включающий гомогенизацию измельченного сырья, выделение активной фракции, осаждение, очистку с помощью хроматографии и элюнрование целевого продукта 1 .Однако известным способом выделяют биологически активные вещества, представляющие собой гетерогенные препараИзвестен способ получения тнмостерина А из тимуса телят, включающий измельчение сырья, обработку физиологическим раствором, осаждение липнд-белкового комплекса ацетоном, обработку полученного осадка раствором щелочи в кипящем спирте, последующую его экстрак цню органическим растворителем, очнстку дн пособ не обеспечивает выделения целевого продукта с дотаточно высоким выходом и чистотой.Целью изобретения является повышение выхода и чистоты целевого продута.0 Поставленная цель достигается тем,что в способе получения тнмостерина Аиз тнмуса телят, включающем измельчение сырья, обработку физиологнческнмраствором, осажденне Йипид-белковогокомплекса ацетоном, обработку полученного осадка раствором щелочи в кипящемспирте, последующую его экстракциюорганическим растворителем, очистку 20полученного экстракта хроматографиейна колонке н элюированне целевого прота смесью органических растворите, нзмельченный тимус животных инбируют в физиологическом растворе пр3 10015-37 фС в течение 30-60 мин, далеепосле осаждения липид-белкового комплекса и его обработки кипящим растворомщелочи в этаноле проводят зкстракциюполученного осадка диэтиловым эфиром, 5а очистку экстракта осуществляют вначале ацетоном, затем надосадочнуюжидкость упаривают, остаток растворяютв бензоле, наносят на колонку с окисьгалюминия и элюируют целевой продуктпоследовательно гексаном и затем гексанбензолом при соотнорений (1:2) - (1;1)и бензол-диэтиловым эфиром при соотношении (90:95) - (10;5),Способ поясняется следующими приме 13рамиП р и м е р 1, 10 кг массы, очищенной от кровеносных сосудов тимуса телят и измельченной на гомогенизаторе,инкубируют с 30 лфизиологического раст вора при 37 фС в течение 60 мин. Подученную смесь фильтруют через капроновыйфильтр и в фильтрат постепенно добавляют охлажденный ацетон лри -э С дляосаждения лилид-белкового комплекса23(ЛБК). Из указанного количества сырьяполучается 900 г ЛБК, который омыляют 20%-ным этанольным раствором КОНпри 78 С в течение 1 ч и неомыляемуюфракцию экстрагируют диэтиловым эфиром, ЗфДля очистки экстракта от холестеринапроводят кристаллизацию в ацетоне, после чего надосадочную жидкость неомыляемой фракции упаривают в вакууме, затемрастворяют в бензоле и наносят на колонку с окисью алюминия. Колонку промывают сначала гексаном для удалениясквалена, затем смесью гексана и бензолапри соотношении 1;1 для удаления пигментов, а фракцию, содержашую целевой продукт, элюируют смесью бензол-диэтиловыйэфир при соотношении 90:5,Контроль за составом каждой порцииэлюатов осуществляют с помощью газового хроматографа маркиСгоуи= 31. ю1Фракцию, содержащую целевой продукт,концентрируют и наносят на тонкий слойсиликагеля с 13% гипса, разгоняют вбензоле. Целевой продукт находится вхроматографической зоне с К= 0,22, фего элюируют диэтиловым эфиром. Послеотгонки растворителя получают желтоватые кристаллы, которые залаивают в ампулу. Выход целевого препарата 25 мг.П р и м е р 2, 10 кг измельченноготимуса телят инкубируют лри 35 С в течение 30 мин. Из указанного количествасырья получают 900 г ЛБК. Осадок ОМ 4ЛБК подвергают щелочному гидролизу в12% этанольном растворе КОН при 78 Св течение 2 ч, Неомыляемые веществаЛБК зкстрагируют дизтиловым эфиром.Удаление основной массы холестеринанеомыляемой фракции проводят кристаллизацией в ацетоне, после чего надосадочную жидкость концентрируют в вакуумеи подвергают колоночной хроматографии наокиси алюминия, Очистку от сквалена ипигментов проводят, как в примере 1.Фракциюсодержащую целевой продуктэлюируют смесью бензол:дизтиловый эфир(90:10), которую после упаривания нароторном испарителе, хроматографируютна тонком слое силикагеля ЛС 5/40 0с 10% гипса в бензоле, Целевой продукт,расположенный в зоне, характеризующейся 1 у 0,25, элюируют из адсорбента диэтиловым эфиром. Выход препарата 20 мг.П р и м е р 3. 10 кг измельченноготимуса дикого северного оленя инкубируют при температуре 36 С в течение 40 минв физиологическом растворе, Из указанного количества сырья получают 1,2 кглилид-белкового комплекса (ЛБК). Ссадок ЛБК омыляют 15%-ным этанольнымрастворомКОН при температуре кипенияэтанола 78 С в течение 1,5 ч, а затемоэкстрагируют, как описано в примере 1.Очистку от холестерина и сквалена проводят так же,как и в примере 1, Удалениепигментов осуществляют на колонке элюированием смесью гексан-бензол в соотношении 2;1, а затем бензол-диэтиловымэфиром в соотношении 95:5. Выход продукта 30 мг.Степень очистки целевого продуктаконтролируют на газожидкостном хроматографе СЬ"ОМ = 31 при следуюшихстандартных условиях: колонка 1,8 мх 6 мм, заполненная носителем СЙГОюОЬЪМ-АФ ЭМС 5, обработанным 3%-ным51 Е 1 СОИ Ь 30 (СЬЕВОРОС ЧСС ),диаметр частиц 0,160-0,200 мм, газноситель-аргон, скорость 25 мм/мин. Рабочая температура колонки 250 С, темопература инжектора 280 С, Скорость водорода 50 мл/мин, скорость воздуха 500 мл/мин,Относительное время удерживания целе/вого продукта (ло сравнению с холестерином) составляет 2,23,время удерживания целевого2,23 =йродукта время удерживания холестеринагБиологическая активность подтверыденаэкспериментально в опытах на животных,у которых после введения препарата на5 10019 блюдали стимуляцию иммунологического ответа. Инкубирование в течение 60 мин в среде с предлагаемым препаратом лимфэцитов периферической крови больных туберкулезом, ревматоидным артритом вос .5, станавливает их функционап ную активность, процесс бласттрансформации стимулируется, способность к розеткообразованию возрастает до нормальных показателей, т.е. предлагаемый препарат иэ 1 э тимуса способен стимулировать дефектные лимфоциты.Заявляемый способ позволяет получить высокоочищенный препарат (88-90%) иэ сырья животного происхождения с 1 ф выходом 2-3 мг из 1 кг тимуса. При упрощении технологии получения целевого продукта увеличивается его выход в 2 раза и обеспечивается более высокая степень очистки, 20формула изобретенияСпособ получения тимостерина А иэ 2 тимур телят, включающий измельчение сырья, обработку физиологическим раствором, осаждение липид-белкового комплекса ацетоном, обработку полученного осадка раствором щелочи в кипящем спир-Зэ те, последующую его экстракцию органиЗй 4ческим растворителем, очйстку полученного экстракта хроматографией на.колонкеи элюирование целевого продукта смесьюорганических растворителей, о т л и -ча ющ и йс ятем, что, с цельюповыщения выхода и чистоты целевого продукта, измельченный тимус животных инкубируют в физиологическом растворепри 35-37 С в течение 30-60 мин,далее после осаждении липид-белковогокомплекса и его обработки кипящимраствором щелочи в этаноле проводятэкстракцию полученного Осадка диэтиловым эфиром, а очистку экстракта осуществляют вначале ацетоном, затем надосадочную жидкость упаривают, остаток растворяют,в бензоле, наносят наколонку с окисью алюминия и элюируютцелевой продукт последовательно гексаноми затем гексан-бензолом при соотношении (1:2)-(1:1) и бензол-диэтиловымэфиром при соотношении (90:95)-(10;5),Источники информации,принятые во внимание при экспертизе 1. Авторское свидетельство СССР% 706089, 1979, кл, А 61 К 37/24. 2, Автореферат,канд. диссертации С. Н. Тихонова фИсследование биологических свойств стеринов вилочковЪй железыф, Киев, 1975.Составитель В. БрусиловскаяРедактор Н. Аристова Техред К,Мьшьо Корректор Е РошкоЗаказ 1674/2 Тираж 711 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5 филиал ППП фПатентф г. Ужгород, ул, Проектная, 4