Способ получения диагностикума

(72) Авторы изобретения Е.П. Москаленко, В.М. Лубэ и Н.К, Литвинов Ростовский ордена Дружбы народов медицинский институт(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИКУИА 1Изобретение относится к областимедицины и может найти применение влабораторной диагностике коклюша,особенно при индикации бессимптомных иликлинически слабо выраженных форм инфекции. 5Известен способ получения коклюшного антигенного диагностикума путемобработки формалинизированных эритроцитов танином с последующей сенсибилизацией их антигеном и фиксациейформальдегидом1 )Однако известный способ недостаточно чувствителен,Целью изобретения является повышение чувствительности диагностикума.Указанная цель достигается тем,что при осуществлении способа формалинизированные эритроциты сенсибилизируют антигеном и фиксируют формальнодегидом,Отличительной особенностью способа является то, что эритроциты до сен"сибилизации обрабатывают ультразвуком 2при частоте 42-50 кГц и амплитуде 60- 80 мкм в течение 5- 15 мин а сенсилилизацию осуществляют при ультразвуковом воздействии в том же режиме в течение 1-3 мин в начальный период контакта эритроцитов с антигеном.Способ осуществляется следующим образом.формалинизированные эритроциты барана отмывают от формальдегида нейтральным (рН 7,0-7,2) стандартным солевым раствором, содержащим 0,853 хлорида натрия (МаС 1) и 045 натрия лимоннокислого трехзамещенного (СЬНО.3 НО) . Полученный эритроци" тарный осадок ресуспендируют в стандартном солевом растворе, готовят 5-15 эритроцитарную взвесь и подвергают ее ультразвуковому воздействию (частота 42-50 кГц, амплитуда 60- 80 мкм, экспозиция 5-15 мин). Обработанные ультразвуком и однократно отмытые стандартным солевым раствором формалинизированные эритроциты соеди"Ф Наименование агента воз- действия Характер воздействия на формалинизированные эрит- роциты с паракоклюшнойагглютинирующейсывороткой с коклюшной агглютинирующей сывороткой 1,4+п,13 3107+0,22 Химическое Таниновая кислота5,20+0,25 3,13+0,30 физическое 6,42+п,16 Ультразвук 3,21+0,18 П ри ме ца ни е; активность диагностикумов представлена в 1 Х геом, р 95обратных величин титров коклюшной и паракоклюшной агглютинирующей сыворотки,3 1001няют с ультразвуковым антигеном, смесьподвергают воздействию ультразвука втечение 1-3 мин, Последующий контактантигена с эритроцитом осуществляютпри температуре 37 С в течение 1-2 ч. зЗатем в полуцаемый препарат добавляютформальдегид (1), хранение готовогопрепарата осуществляют в присутствииформальдегида,Контрольный препарат готовят аналогичным образом, исключая сенсибилизацию эритроцитов коклюшным антигеном.Способ поясняется следующим примером.П р и м е р, Эритроциты барана кон сервируют формальдегидом по методуЧизмеса в модификации М.И. Леви с соавт. (1965).Для получения антигенов используют культуру Вогдейе 11 а регйцзз 1 в 20штамм 305, выращенную на кузеиновоугольном агаре (среда КУА) при температуре +36 дС в течение 72 ч. Выращенные микроорганизмы собирают с питательной среды, суспендируют в стерильном 0,85/-ном растворе хлорида натрия рН 7,0-7,2, доводят густоту микробной извести до 1500 МЕМ в 1,0 млпо оптическому стандарту Государственного контрольного института меди- ЗОцинских биологических препаратов им.Л.А. Тарасевича, Микробную взвесьдезинтегрируют ультразвуком (частота42-50 кГц, амплитуда 60-80 мкм, экспозиция 10- 15 мин), антиген отделяютцентрифугированием при 18000 об/мин,в течение 60 мин при +5 дС.Для получения диагностикума504-ные формальнизированные эритроциты отмывают нейтральным стандартнымсолевым раствором (1440 д, 2-3 мин),доводят эритроцитарную взвесь до кон 140 4центрации 5-15/ и подвергают ультразвуковому воздействию (частота 4250 кГц, амплитуда 60-80 мкм, экспозиция 5- 15 мин). Затем эритроциты от"мывают стандартным солевым раствором,ресуспендируют и к суспензии эритроцитов добавляют антиген в дозе 510 мкг по белку на 1,0 мл эритроцитов и смесь дополнительно подвергаютультразвуковому воздействию в течение 1-3 мин.Экспозиция сенсибилизации составляла 1-2 ч при температуре +37 С, дляостабилизации готового препарата добавляют 13 формальдегида, По окончании процесса проводят отмывание эритроцитарного диагностикума от излишков и связанного антигена. Хранениепрепарата осуществляют в присутствии14 формальдегида,Активность контрольных препаратов,а также опытных диагностикумов, приготовленных при воздействии на эритроциты таниновой кислоты (по способупрототипа), а также предлагаемым способом при ультразвуковом воздействиисенсибилизируют ультразвуковым коклюшным антигеном и исследуют в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА),параллельно с реакцией торможенияпассивной гемагглютинации (РТПГА).Кроме того, специфичность исследуемыхдиагностикумов проверяют при постановке РПГА с гетеролсгицной (паракоклюшной) системой.В табл. 1 представлены опытные данные по изучению активности и специфичности диагностикумов, полученных придействии таниновой кислоты и ультразвука, с целью повышения гемосорбционной активности формалинизированныхэритроцитов барана.Таблица 2 Активность диагностикумов в РПГА Воздействие УЗ в процессе гемосорб- ции Наименование Характервоздействия наформалинизиро"рованныеэритроциты барана агента воздействияс паракоклюшной агглютинирующейсывороткой с коклюшной агглютинирующейсывороткой 1,15+0,26 1,2010 11 3,07+0,17 3,2810,09 Химическое Таниноваякислота 3,14+0,28 5.20+0 25 ,1+0,28 5,96+0,16 6,42+0,23 3, 16+0,19 3, 21+0, 183,22+0,19 Физическое Ультразвук П р и м е ч а н и е: активность диагностикумов представлена в 1 д Хгеом, 1 р 95 обратных величин титров коклюшной и паракоклюшной агглютинирующей сыворотки. Анализ полученных результатов сви 50 детельствует о возрастании специфической активности диагностикумов (Р 0,05), полученных при дополнительном ультразвуковом воздействии в начальный период контакта антигена с .эритроцитами, обработанными ультразвуком.Таким образом, способ позволяет получить диагностикум высокой активности и специфичности. формула изобретения Способ получения диагностикума путем сенсибилизации формалинизированных эритроцитов антигеном и фиксации формальдегидом, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения чувствительности диагностикума, эритроциты до сенсибилизации обрабатывают ультразвуком при частоте 42-50 кГц и В 1001940 йАнализ полученных результатов сви- сывороткой, при постановке РПГА с гедетельствует о значительном повыше- терологичной (паракоклюшной) сЬворотнии специфической активности диагнос- кой активность диагности,.умов была в тикумов, полученных предлагаемым спо-3000 раз ниже 0,01 сРс 0,02. собом по сравнению с прототипом В Кроме того, кратковременное приме- (О,ОХРЯНО,05) . нение ультразвука в начальный периодДанные РТПГА и перекрестной РПГА сенсибилизации эритроцитов ультразвус паракоклюшной агглютинирующей сыво- ковым коклюшным антигеном позволяет роткой позволяют отметить "высокую повысить специфическую активность по- специфичность диагностических прела В лучаемого диагностикума и увеличить ратов, приготовленных предлагаемым эффективность способа в результате способом, по сравнению с прототипом. более равномерного распределения анДанные эритроцитарные ультразвуковые тигена, улучшения условия контакта диагностикумы имели высокие титры в антигена и эритроцитов и возможной РПГА (до 1:9,6 млн) прй постановке И активации антигена под действием ультреакции с гомологичной (коклошной) развука (табл. 2).Заказ 1674/2 Тираж 711 Подписное ВНИИЛИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 7 1001940 8амплитуде 60-80 мкм в течение 5-15 мин Источники информации,а сенсибилизацию осуществляют при принятые во внимание при экспертизеультразвуковом воздействии в том жережиме втечение 1-3 мин в начальный пе; Каральник В. В. Эритроцитарныериод контакта эритроцитов с антигеном.диагностикумы. 1976, с. 84,