Способ получения ферментного препарата глюкоизомеразы

ь,ОБРЕТ АТИНТ 2. Способ щ и й ся т 2-пропанола са поддержив ной 41-43 маАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ ОПИСАНИ(72) Роберт Пол Кори (США)(71) СПС Интернэшнл Инк (США)(54)(57) 1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА ГМЮКОЗОИЗОМЕРАЗЫ, предусматривающий обработку биомассыпродуцента лизоцимом, отделение бесклеточного экстракта и выделение изнего фермента осаждением, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с цельюупрощения процесса, а также повыше"ния активности и стабильности препвграта, в качестве продуцента используют 5 йгерйоаусез о 1 чосЬгово 9 епезАТСС21713, АТСС У 21715, биомассупродуцентапредварительно обрабатывают водным раствором 2-пропанолапри концентрации последнего в смеси4143 мас,Ф, лизоцим используют вколичестве 6,8 ед/мг сухого веса клеток а осаждение Фермента осуществляют сульфатом магния, взятым аколичестве 0,02-0,3 И на общий объемсмеси. по п.1, о т л и ч а юм, что концентрациюа всех стадиях процесют постоянной и рав18 17 1024014дии выращивания. После завершения э ферментации разводку в 20000-галон- р ном 75708-литровом) Ферментаторемоохлаждают до 20 С. Ее выдерживают щ беэ продувания воздухом и перемеши-и вания в течение. коротких периодов ч времени перед концентрацией клеточ"ных твердых частиц. Конечная разводка (16000 галлонов или 60565 л) У имеет активность 21,0 ИЕИГ 1,грамм 10 л разводки)максимальный выход по су- з хим клеткам 16,5 г/л и общую.ак"тивность 1270,7 х 10 ИЕИГ.Всю разводку, содержащую внут- Рриклеточную иэомераэу глюкозы, кон." 15 Р центрируют центрифугированием на с центрифуге "Де Лаваль БРПХ"207 т для концентрирования клеточных твер- т. дых частиц при рабочем расходе по- чдачи примерно 5,0 галлонов19 л ) 20 и в минуту при коротком времени выб- м расывания 1,75 мин Легкофазный пе- и реливающийся продукт периодически д анализируют и выбрасывают. Выбросы д тяжелофазной клеточной пасты соби э рают в приемном бачке, а затем мелпрерывно перекачивают в один изитрех чанов, которые используют для ц дегидрирования, Стадия концентриро" т вания дает в результате примерно ЗО д 64-кратную концентрацию клеточных 1 твердых частиц ,в расчете на объем). . о Общее количество извлеченной клеточной пасты 2500 галлонов (9463,5 л)ивесом 20709 фунтов (9393,4 кг) приобщем весе сухого вещества 2431 фунт т (1102,6 кг). Анализ клеточной пасты показывает наличие 289 фунтов 3 (131,09 кг) золы, 1433 фунта(649,99 кг протеина, 18278 Фунтов (8290,76 кг) водыактивность 132 МЕИГ/г и: общую активность 1240,0 х 10 ИЕИГ (983 от з общей активности). Н Когда объем клеточной пасты в варочном чане достигает 200 галлоновф 5 (757 л) производят добавление в шлам200-230 галлонов (757-870,6 л) . 91,5-ного 2-пропанола до заполнения варочного аппарата, После каждого. добавления спирта проверяют рН получаемого шлама в соответствующем варочном аппарате и доводят до 7,0-7,2 при необходимости с по-. мощью безводного первичного кис" . лотного Фосфата натрия. После первоначального добавления спирта в соответствующие чаны производят добавление в возрастающих количествах нзима лизоцима по всему балансу пе-,иода заполнения при дозировке приерно 6,8 ед/мг клеток (на сухое веество). Использовавшийся лизоцимредставляет собой 2-х кристалли-еский высушенный замораживаниеморошок, изготовляемый компаниейИайлс-Сирэйвэк" из яичного белка сказанной активностью 23000 единицизоцима на миллиграмм препарата энима,После того, как каждый чан заполнен, производят окончательноеегулирование длй доведения концентации спирта в шламе до 42+1/ по веу. Лиэат (шлам, состоящий из спира, клеточной пасты и лизоцима) посоянно перемешивают и рециркулируютерез наружные теплообменники дляоддержаний нужной температуры. Вежтрубную зону теплообменниководают охлажденную воду для подержания температуры лиэата в преелах 28-30 С. Степень растворимостинзима проверяют сравнительным анаиэом энзима всего образца лизатачасти того же образца, иэ которогоентрифугированием удаляют клеточныевердые частицы. Когда дигерированиеэнного аппарата достигает примерно00 сольватации, шлам лиэата легкосветлить для удаления остатков клеок, Время дигерирования составляетримерно 52-73 ч, считая со стадииаполнения. Весь шлам лизата,иэрех варочных аппаратов имеет общийобъем 5138 галлонов(1994494 л) вес9590 .Фунтов ( 17957,72 кг) и общееоличество сухого вещества 2247 фунов (1019,2 кг), Анализ шлама лизатапоказал наличие 414 фунтов(187,78 кг)олы, 1431 фунта (649,09 кг) протеиа, 15920 кг (7221,2 кг) 2"пропанолаи 21423 (9717,3 кг) воды, Лизат имеет единичную активность 66,6 ИЕИГ/ги общую активность 1178,9 х 10 ИЕИГчто составляет 934 первоначальной общей активности разводки Ферментации.Ц 1 лам лизата осветляют с помощьюфильтра с предварительно нанесеннымслоем фильтрующего материала "Дайкэлайт Спидфлоу" 1,производимый компанией Грефко Инкорп,) толщиной 2,252,5 дюйма, Для осветления шлама лизата используют в целом 600 фунтов( 272,16 кг Фильтрующего материала,В шлам для предварительного слоя добавляют 50-ный раствор 2-пропанолапри концентрации 54. Для сохранения1024 014 20 19свежего раствора для нанесения предварительного слоя, когда предварителы ный слой нанесен, нижнюю 4 асть предВарительного слоя по капле сливают обратно в резервуар для свежего материала для предварительного слоя. Немедленно после слива нижней части предварительного слоя дигерированный шлам лизата направляют на фильтр. Скорость фильтрации для стадии ос О ветвления изменяется от 2,6. галлонов/ч фут до 3 9 галлонов/ч-фут(9,8 л/ч,093 м -14,76 л/ч -0,093 м)при средней скорости пропускания материала 2,9 галлона/ч-фут (10,97 л/ч-0,093 м), После Фильтрации осветленный фильтрат перекачивают в 1000"галлонные .(3785-литровые) хранилищные емкости. Вырезки фильтровальйой лепешки из фильтра перно" дически подвергают анализу и выбра" сывают, Весь лизат имеет объем 4638 галлона (17556 7 л), вес 35716 фунтов (16200,5 кг) при общем весе сухого вещества 774 фунта (351,08 кг). Анализ осветленного лизата показал наличие 106 Фунтов (48,08 кг) золы, 492 Фунта(223,17 кг) . протеина, 15798 фунтов (7165,9 кг) 2-пропанола и 19122 фунта (8673,59 кг) воды. Единичная активность осеет- ЗО ленного лизата 54,0 ИЕИГ/г, а об-" щая активность 875,7 х 10 ИЕИГ, что составляет 693. первоначальной актив. ности из ферментационной разводки,Э 5 После стадии осветления концент" рацию осветленного лизата в отдельных чанах увеличивают до 44-454 по весу (определялась по удельному весу перед обработкой по всем стадиям фО осаждения,и стабилизации), Осаждение и стабилизация энзима иэомеразыглюкозы в растворе осветленного лизата осуществляется непрерывной дозированной подачей осветленного ф 5 лизата и 2,2 И раствором Ид 0 и 941 фунта (426,8 кг) воды через смесительный тройник ("Т") впитающий чан, который соединен с центрифугой "Де Лаваль БРПХ". 2,0 И раствор ,ЗО сульфата магния добавляют при расходе подачи 0,025 галлона на галлон (0,.0946 л на 3785 л) осветленного . лизата для обеспечения конечногораствора с 0,05 И концентрацией 55 Ид 50. Пускают поток раствора 8950, раствора осветленного лизата и в питающем чане создают нужный уровень. Чан заполняют до объема,который при данных расходах подачидал время пребывания в 15 мин.Затемсмесь подают на центрифугу при расходе эквивалентном расходу подачи впитающий чан. Расход подачи на центрифугу регулируют таким образом, чтобы поддерживать уровень постоянным(и время пребывания также постоянным,т.е. примерно 15 мин) в питающем чане Перетекающий из центрифуги про" дукт направляют на 8000-галлонный (30283-литровый) резервуар и дополнительно обрабатывают для извлечения 2-пропанола: для повторного использования. Стабилизированный концентрат энзима собирают в 20-галлонных (75,7"литровых) емкостях из нержавеющей стали, .а затем смешивают в 100- галлонной (379-литровой) емкости с перемешиванием. Стабилизированный концентрат энзима имеет средне-коричневый цвет. Производят периодичесюе .добавление воды для стабилизации концентрата энзима и для обеспечения повторной растворимости энзима, если это требуется (повторная растворимость определяется визуально), Когда добавляется дистиллированная вода и стабилизированный концентрат энзима растворяется, цвет его переходит в относительно светлый кофейный цвет. и его консистенция соответствует консистенции светлого нефтепродукта. Извлеченный стабилизированный (в повторно растворимой форме) концентрат энзима имеет объем 73 галлона (276,3 л), вес 634 фунта 1 287,57 кг У и сухого вещества 169 фунтов (76,66 кг) Анализ стабилизированного концентрата энэима показал наличие 19 фунтов (8,6 кг) .золы, 126 фунтов (57,15 кг) протеина, 104 фунта (47, 17 кг) 2-пропанола и 360 Фунтов (163,29 кг) воды. Стабилизированный концентрат энзима имеет единичную активность 11,654 ИЕИГ/г (на сухое вещество) и общую активность 892,8 х 10 ИЕИГ/г, что представляет 70,3 выхода извлечения общей активности всей клеточной разводки, использовавшейся в качестве исходного материала при мак" симуме потерь (23-24), происходящих на стадии осветления лиэата. Из этого количества около половины (примерно 11,8 ф) может быть отнесено21 В табл, 5 (загрузка 11) приведе" ны сведения об эффективностях извлечения энзима на всех стадиях обработки. В табл, 6 приводятся результаты анализа стабилизированного концент" рата энзима,Удельная активность,ИЕИГ/мг, протеинСухое вещество,11,3 Нерастворимое сухоевещество.сухойвес 0,53 5,99 М 9 , мг/мл Конечный вес извле"ченного энзима, кг насухое вещество 287,58Данные, приведенные в табл,б указывают на то, что стабилизированные концентраты энзима могут сохранять более чем 80 ф 10 (и обычно больше чем 90+10 / своей первоначальнойизомеразной активности до 12 мес при хранении при 4 и 18 С и способны сохна вырезки фильтровальной лепеш"ки. П р и м е р 4. Несколько образ" цов извлеченных стабилизированных концентратов энзима изомеразы глюкозы по примерам 1-3 и другие по" добные образцы подвергают испытаниям для определения. их стабиль" ности при хранении при различных тем пературах. Образцы хранят при 4, 18, 26 и 370 С и анализируют на изомеразноглюкозную активность с интервалами в 4,8 и 12 месяцев.Ниже приведен анализ стабилизированного концентрата знзима изомеразы глюкозы загрузки ИМ 11-336 Изомеразная активность, ИЕИГ/г, сухой 11654 Влажность(Карлфишер),ФПротеин, Кьельдаль,Фсухое веществоЗольнэя окись Фсухое вещество М 9, молярный 0,25 И 9 ф протеин, соот,032 ношение 2-пропанолФ(по разнице) 16,5 1024014 22ранять до 80 + 107. своей первоначальной изомеразной активности до 8 меспри хранении при 26 С, т,е. стабилизированные концентраты энзима проявляют в среднем менее чем 5/ потерь первоначальной изомеразной активности при хранении при 4 С в течение 12 мес, среднюю величину потери менее чем примерно 151 своей пер 10 воначальной активности при хранениив течение 12 мес при 18 и 26 С.П р и м е р 5. 17-галлонную64,35-литровая ) загрузку разводки,содержащей внутриклеточную изоме 5 разу глюкозы, приготовленную по примеру 1(А ), разбавляют водой и центрифугируют для получения клеточнойпасты. 17-галлонная загрузка разводки взята из двух загрузок 10-галлон 20 ного (37,853-литрового) ферментаторас активностью 18,0 ИЕИГ/мл и16,8 ИЕИГ/мл соответственно, Обе загрузки смешивают для использованияпри приготовлении клеточной пасты.25 Полученную при центрифугировании лепешку ( клеточная паста ) помещают в55"литровый бродильный сосуд и разбавляют водой до получения общегообъема шлама 4,5 л. Шлам, который0 хранился при 4 С в течение двух дней,обрабатывают 77 мг препарата энзимализоцима (; полученного из яичногобелка, имеющего примерно 8000 лизозимных ед/мг) и 1930 мг 2-пропанола,Влам перемешивают в течение 4 ч,после чего производят добавление500 мг препарата. энзима лизоцима,Шлам перемешивают в течение ночис регулированием температуры до 204030 фС (температура увеличиваласьпримерно на 35-40 С после второгоодобавления лизоцима, которое вызвалонекоторую дезактивацию энзима).После дигерирования 500-миллиметровый образец разбавляют.500 мл ф 5 воды, 123-миллилитровые аликвотные доли разбавленного лизата доводят примерно до 503 2-пропанола(в расчете на объем/объем) путемдобавления 2-пропанола. Одна алик вотная доля лизата используется дляконтроля. К каждому аликвотному образцу лизата добавляют указанныеглюкозную активность и содержаниепротеина.Приведенные в табл.7 результатыпоказывают, что добавление соли суль,фата магния в лизат спирт - водаприводит к снижению изомеразной активности во всплывающем слое безсущественного уменьшения содержания нуклеиновой кислоты во всплывающем слоенуклеиновые кислоты поглощают свет при 260 нм), Этот эффектне имеет места при добавлении солихлористого натрия. Следовательно,добавление соли сульфата магния влизат из спирта и воды вызывает выделение изомеразы глюкозы из растворимых нуклеиновых кислот,Наблюдавшееся явление очевидноне было типичным эффектом "высаливания", так как уровень сульфата магния был слишком низким, а результатпри хлористом магнии был противоположным. Эксперименты с хлористымнатрием не вызывали какого-либо су",щественного снижения изомеразной ак"тивности во всплывающем слое.П р и м е р 6, Для сбалансирования 4,5 л сырого лизата ( содержащего изомеразу глюкозы с приданнойрастворимостью) из примера 5 производят добавление вспомогательногофильтрующего материала и достаточно"го количества 2-пропанола для того,чтобы превратить шлам в 50; по отношению к 2-пропанолу в объемном от"ношении (объем/объем). Шлам медленно профильтровывают до осветлениярастворенной изомеразы глюкозы. Анализ 335-миллилитрового образца фильтрата показывает 65,2 МЕИГ/мл (общее21,842 МЕИГ), В этот образец добавляют 16,5 мл 2-пропанола и 16,5 млодномолярного раствора сульфатгептагидрата магния (Мц 504. 7 НО) прирН 8. После добавления соли немедленно образуется маслянистый преципитат, Раствор, содержащий преципитат,центрифугируют и преципитат удаляют.Преципитат повторно растворяют водой до общего объема 10,5 мл. Этотобразец разбавляют водой до общегообъема 10,5 мл. Образец разбавляютводой до 402 к 1 и светопропускаемость разбавленного раствора при260 и 280 нм составляет 0,284 и0,350 соответственно. Анализ раствора показан 2040 МЕИГ/мл, Следовательно, его общая активность 21400ИЕИГ (981 начальной активности, 45 50 55 П р и м е р 8, 3250 мл осветлен- ного лизата, содержащего растворенную иэомеразу глюкозы, имеющую 109 ИЕИГ/мл ив первоначальной 4,5- литровой загрузки, указанной в примере 5, смешивают со 162 мл раствора 2"пропанола и 162 мл раствора одномолярного сульфатгептагидрата магнияНемедленно образуется маслянистый осадок, который собирают центрифугированием, Преципитат имеет объем 69 мл.его анализ показал 4,040 ИЕИГ/мл при общей величине 278,760 МЕИГ,. Для анализа производят 1-1000-кратное растворение небольшой части стабилизированного концентрата энзима. Его светопропусполученной из осветленного лизата).Стабилизированный концентрат энзима,изомеразы глюкозы имеет удельнуюактивность 15,3 ИЕИГ/мг протеина.,Таким образом сульфат магния селективно осаждает и очищает энзим изомеразы.П р и м е р 7. 67-миллилитровыйобразец повторно раствбренного Фрак ционата спирта, содержащего растворенную, не содержащую клеток изомеразыглюкозу, перемешивают с 67 млраствора 2-пропанола, Не наблюдаетсяникакого преципитата; После этогопроизводят добавление 2 мл одномолярного раствора сульфатгептагидратамагния и 2 мл раствора 2-пропаноладля осветления.,водно-спиртового раст.вора, содержащего иэомеразу, Немедленно . после этого образовалсясеро-белый твердый преципитат, который извлекают и растворяют в водедо объема 13,0 мл. Стабилизированный концентрат энэима повторно цент рифугируют и разбавляют водой до10 1 к 1 для ,.проведения количественного анализа. Светопропускаемостьразбавленного раствора при 260 м и280 нм 0,288 и 0,437 соответственно.Содержание протеина разбавленногораствора определяют в 0,46 мг/мл.Следовательно, неразбавленный раствор, включающий растворимый, стабилизированный концентрат энэима, содержит 46,5 мг/мл протеина, анализкоторого показал 482 ИЕИГ/мл и удельную активность 10,4 ИЕИГ/мгпротеина. Общая активность в 13,0 млстабилизированного концентрата энзи 4 фма 6,266 МЕИГ. Отцентрифугированныйматериал содержит всего 150 ИЕИГ.25 102 ЦОкание при 260 и 280 нм 0,315 и О,ЗЙ 5соответственно. Содержание протеина0,299 мг/мл, удельная активность13,5 ИЕИГ/мг протеина, Балансовомуколичеству стабилизированного концентрата энзима дают отстояться втечение 8 ч после чего образуетсятри слоя, Трехслойный шлам центри" фугируют и подвергают анализу. :18,2-миллилитровый верхний липоид ный) слой имеет 565 ИЕИГ/мл, 39-миллилитровый средний слой - 1970 ИЕИГ/мли 36-миллилитровый слой " 50,80 ИЕИГ/мл Нижний слой обладает наиболее низкой светопропускаемостью при 260 нм 15 и наиболее высокой при 280 нм, Верх" ний. слой имеет наиболее высокую све-топропускаемость при 260 нм,П р и и е р 9, 27,5-галлонную за" . грузку разводки, содержащую.175 ИЕИГ/мл внутриклеточной изомеразы глюкозы, приготовленную по примеру 1 (,А ), смешивают с равным ко" личеством воды и центрифугируют до образования лепешки. Лепешку смеши веют с водой до объема 26 л при рй 7,15, К этому раствору добавляют 0,250 г лиэоцима и 11,5 л 2-пропа нола при 270 С. Добавляют небольшой количество противопенного агента и шлам перемешивают. 37,5-литровая водная суспензия содержит .37- ЙЬ ИЕИГ/мл. После 205 ч извлекают две 8-литровых аликвотных доли, пос" ле чего добавляют 2-пропанол в таком количестве, чтобы довестй сбъеМ33 до 50 в объемном соотношении(объем на объем,Производят добавление вспомогательного фильтрующего мате риала Сил-фао (3 г/г клеток) к40 шламмам, которые после этого фильтруют и промывают 2 л 503-ного 2-пр 0- панола. Анализ фильтрата показал15 ИЕИГ/мл. Добавляют при первмешивании дополнительно 1 г лизоцима в 21,5-литровый баланс сырого ли"4 эата с получением 243 ИЕИГ/мл,Содер жащийся в фильтрате энзим немед" ленно осаждают в фильтрат с добавлением 1,1 одномолярного . раствора сульфата магния и 1, 1 л 50 2-пропанола. Преципитат, содержащий стабилизированный концентрат энзима, извлекают центрифугированием и растворяют в небольшом коли" честве водыдо получения объема 200 мл, 5 имеющих примерно ЗИО ИЕИГ/млили вце лом 690000 ИЕИГ иудельную активность примерно 125 ИЕИГ/мл протеина; 26Два образца из 200-миллилитрового стабилизированного концентратаэнзима подвергают испытаниям настабильность при хранении при команатной температуре (примерно 26 С)с последующим проведением повторного анализа. В начале испытанййна стабильность при хранении обаобразца имеют примерно 3300 ИЕИГ/мл,Образцы периодически анализируюти на 31 день хранения образец вместс с добавленным предохранительнымсредством показал при анализе3165 ИЕИГ/мл, а другой образец ( беэпредохраняющего средства) 3110 НЕИГ/млТаким образом, стабилизированные кон"центраты энэима(с предохраняющимисредствами или без него) одинаковостабильны при хранении и способнысохранять до или больше 954 своейпервоначальной активности в течение более 30 дней при хранении прикомнатной температуре,П р и м е р 1 О. Сравнительныеэксперименты, Цель экспериментовпоказать эффективность используемыхРазличных еодорастворимых солей магйия в соответствии с изобретениемв сравнении с другими слоями, способными осаждать протеины, такиекак сульфат аммония сульфат нат",рия и хлористый натрий. В сравнительных экспериментах использовалисьтноне и другие двухвалентные соли.Крупный образец лизаЧа (раствориз спирта воды и изомеразы глюкозьдиэ загрузки И 6 (пример 2 и Чабл.3),центрифугируют на лабораторной центрифуге при скорости вращения48000 об/мин в течение 10 мин доиспользования: Содержание спирта. оп"Ределяют в Ч,6 по весу или М 9,3(объем/объем). К каждому из несколь"ких 30-миллилитровых образцов осветленных лизатом (при комнатнойтемпературе), после этого добавляютуказанное количества 1 И растворасолей приведенных в .табл.8 вместес эквивалентным объемом 2"пропанола.После добавления соли и спирта образцы смешивают и затеи центрифугируютпРи скорости вращения 18000 об/минв течение 10 мин. Всплывающие слоиудаляют и преципитаты промывают изтрубок центрифуги и разбавляют до25 шл кобальто-фосфатным буфером21014 28 27 10 ных солей и концентрации, оказываемый на селективное осаждение и очист. ку растворимого энзима изомеразы, .приведен в табл.8.Результаты, приведенные в табл.8 показывают, что сульфат натрия и сульфат аммония не осаждает энзима иэомераэы глюкозы иэ лизата так же эффективно и при такой же, низкой концентрации, как соли магния, Сульфат аммония не осаждает никакого энзима, .а сульфат натрия обеспечил только 194-ное извлечение энзима иэомеразы глюкозы. Это извлечение не обязательно происходит за счет осаждения и может быть отнесено за счет фазового разделения ( фаза спирт-. вода и соль -. вода) . Протеин более растворим в соляно-водяной фазе, чем в. фазе спирт - .вода. Соляно-водяная фаза не дает специфического экстрагирования протеина из водо-спиртовой Фазы. Так как соляно-водяная фаза более плотная, то она собирается как продукт. Другая испытанная моновалентная соль, хлористый нат-, рий, также не дает осаждения энзима изомеразы глюкозы.Двухвалентные соли, иные нежелисоли магния,дают осаждеие энэима изомеразы глюкозы, но степени извле- . чения и чистоты не эквивалентны степеням извлечения и чистоты, получен" ным при использовании солей магния, Соли бария и стронция дали лучшие результаты иэ числа испытанных не- магниевых солей, но использование этих солей нежелательно в кормах. Иэ испытанных солей только соли магния эффективно осаждали энзим с высокой удельной активностью, Использовавшаяся концентрация солей магния представляет. собой небольшую часть .той, что требовалась для осаждения протеина из водного раствора с использованием обычных способов выщелачивания, т.е. с использованием сульфата аммония и натрия.Иэ данных, приведенных в таблице 8, также видно, что при увеличении концентраций сульфата магния (выше 0,08 моль) удельная активность уменьшается, что указывает на более беспорядочное осаждение протеина энэимом изомеразы глюкозы. Наблюдалось, что фазовое разделение происходило при использовании сульфата магния, Понижение удельной активности следовало за явным увеличением растворимости протеина в соляно-водянойФазе. При использовании хлористогомагния и ацетата магния не происходит никакого разделения фаз и удель.ные активности остаются постояннымиесли не происходило увеличения, как .в случае хлористого магния.Иммобилизация растворимой изоме 10 разы глюкозы.П р и м е р 11. 8 данном примерепоказано; что очищенный и стабилизированный концентрат энзима способен производить иммобилизированную15 изомеразу глюкозы с более высокойсвязующей способностью, чем известная изомераэа,Известный препарат иэомераэыглюкозы приготавливают из внутри 20 клеточной изомераэы глюкозы, содержащей целые клетки, приготовленнойспособом по примеру 1( А. С тем, что"бы способствовать извлечению целыхклеток, в разводку добавляют вспомо 25 гательный фильтрующий материалн 511-Г 1 о" и 89(ОН) и смесь затемпромывают 2-пропанолом, высушиваюти измельчают на мельнице Уилея. Вовремя экстрагирования иэомеразыглюкозы иэ клеток смесь, содержащую клетки, обрабатывают Ид 50, в количестве, достаточном для превраще"ния шлама в 0,01 И относительно соли магния, а рН доводят до8,0 с помощью О, 1 И гидроокиси ка 35лия (КОН), Сырой энзим изомеразыглюкозы экстрагируют иэ 6,5-граымового образца ( как основыЬрепарата сухих клеток с помощью 50 мл40экстрагирующего агента. Смесь перемешивают в течение 15 мин при комнатной температуре, а затем центрифугируют при 1 С. Получают экстракт,содержащий 26-27 ИЕИГ/мл. Растворэнзима изомеразы глюкозы, получен 45ныи этим способом и стабилиэирован"ный концентрат энзима, приготовленный в,соответствии с примером 1(8 ),сорбируют на разнообразных водонерастворимых носителях с испольэова 50 нием следующей методики.В 150-миллилитровом химическомстакане 2 г (на сухое вещество) водонерастворимого носителя смешиваютс 30 мл раствора, содержащего 0,1 М55 Ид 50 7 НО и рН доводят до 8,0 спомощью КОН. В эту смесь добавляютдостаточное количество жидкой иэомеразы ( или изомеразы с нормально1 М, 30рузную патоку с высоким содержаниемфруктозы непрерывным пропусканиемраствора глюкозы через биокатализатор, который может быть размещенв колоннах или в листовых (патронных фильтр-прессовых элементах.Из табл. 9 видно, что максимальнаясвязываюшая способность, достигнутаяс использованием изомеразы глюкозыс нормально приданной растворимостью,составляет 936 МЕИГ/г при Селектацелетипа 10, который обладал обменнойспособностью 0,89 дед/г имел несколько более низкую связывающую способность, цем тип 10, тип 20 являетсяболее практичным для промышленногоиспользования, так как имеет болеекрупный размер частиц и, следовательно, дает лучшие расходы потока.П р и м е р 12, При проведенииэтих экспериментов стабилизированныйконцентрат энзима был иммобилизованна ряде водонерастворимых носителейи испытан на использование в непре"Рывной энзиматической переработкеглюкозы в кукурузную патоку с высоким содержанием фруктозы.Используют колонки, приготов"ленные путем помвщения в основании колонки набивки из стекловатыи частичногб заполнения колонки водой, В случае использования водорастворимых носителей в эту колонку добавляют водорастворимые носи- .тели и накрывают набивкой из стекловолокна, Стабилизированный концентрат энзима (загрузка 1, пример1 В) затем медленно пропускают через колонку с последующей промывкойнебольшим количеством дистиллированной воды. Промывная вода и выходящие из колонки потоки смешиваюти подвергают анализу. на изомеразоглюкоэную активность, Количество сор.бированного энзима определяют поразнице,8 слуцае иммобилизованных целыхклеток (продукт примера 1 О, содержащий вспомогательный фильтрующий материал "Сил-флоу") в колонку,соответственно добавляют 5 г препарата энзима, содержащего целые клетки, со 100 мг Мд(ОН) и без таковой.Колонки покрывают сверху набивкойиз стекловаты.Непрерывные переработки проводятся посредством непрерывного питания колонок 503 "бесцветной каквода" повторно растворенной крис 29 10240приданной растворимостью или концентрат энзима соответственно насто"ящему изобретению) для контактиро-,вания носителя с 1,000-3,000 МЕИГизомеразы (в зависимости от емкости.носителя). После этого добавляютдополнительно 0,01 М раствор Ид 0для обеспечения получения жидкогообъема 50 мл, Затеи смесь, содержащую энзим и водонерастворимый 1 Оноситель, тщательно перемешивают втечение 30 мин фильтруют и промывают 0,01 М раствором Мд 50 7 НО.Смешанные фильтрат и жидкости помещают в 250-миллилитровую мерную колбу, разбавляют до нужного объемас помощью 0,01 М раствора Мд 504 7 НОи снова производят анализ первонацального растворимого препарата эн"зима изомеразы на изомеразную активность с использованием анализаторанТекнишэл Ото Энэлизер" (" ТесЫ с 1 апОцео .Апа 1 улег") Связующая способность 1,СС ) для соответствующих водонерастворимых носителей рассчитанапо разнице с использованием следую" .щей формулы СС, ИЕИГ/г, сухое вещество - общее наличие МЕИГ - общее МЕИГв фильтрате и промывках.В табл. 9 представлены результатыэтого эксперимента, сравниваетсясвязующая способность при различныхносителях с изомеразой глюкозы снормальной приданной активностью состабилизированным концентратом энзима соответственно настоящему изоб"33ретению,Данные, приведенные в таблице, показывают, что связующая способностьДЭОЭ-целлюлозы примерно в два разабольше для стабилизированного концентрата энэима, чем для энзима с нормально приданной растворимостью, ав случае синтетических анионообменныхсмол в 2-3 раза больше. Установленочто связующая способность ДЭАЭ-цел 45люлозы для стабилизированного концентрата энзима увеличивается предварительной обработкой носителя приболее низком уровне РН, Например,приРН 6,5 носитель связывает 3120 МЕИГ/г %тогда как необработанный носительсвязывает только 16,311 МЕИГ/г. Прииспользовании данного стабилизированного концентрата стало возможнымсвязать 10,9 млн МЕИГ/фут (0,028 м) 55на ДЭОЭ-целлюлозе типа 20, Этот биокатавизатор затем может использоваться для переработки глюкозы в куку102401431 ру 3. В табл.11 приводятся данные по влиянию энзимной нагрузки на непрерывную переработку (носитель из регулируемой простой окиси алюминия со" З 5. держал 97"98/ А 3 О и 2-2,44 М 90 сплощадью поверхности 780 м/г).Стабилизированный концентрат энзима эффективно сорбируется на носителе из регулируемой пористой окиси 40 45 Таблица 1 Жидкость для замочккукурузы, Код Е 801 20 1-я стадия (Три 1-литровых встряхивающих колбы),0 г) щес таллической декстразой (600 г/л раствора), содержащей 0,004-0,0055 М сульфат магния при рН Р.,4-8,6. В случае необходимости эти колонки уравновешивают, и непрерывная энзоб меризация проводится при 60 С перекачкой воды при 60 С через рубашку колонны. Поток питания через колонку поддерживают сочетанием вакуума в основании колонки и газообразным азотом в питании. Расход потока регулируют изменением давления газа в питании.Кажущаяся энзимная активность (КЭ) определяется с помощью урав- нения где ВЧН - скорость расхода в колон. ке в объемистости слоя/ч,4 е - величина равновесия екстроза-фруктоза, которая при 60 С . составляет 51,2;1 а4 кетозы В Выходящих по токах колонки.Объемы слоя/ч при, 451 левулозы,ВЧН =КЭ/0,916.П 5 олупериод, т.е. время, требуемое для уменьшения до половины кажущейся активности колонки, опре-. деляется отбором образцов в течение двух или более недель работы колонкй и измерением КЭ. Полупериод определяется по крутизне линии, определяемой методом наименьших квадратов, на графике 3 д КЭ относительно времени. При этом методе. предполагается, что скорость распада энзима первого порядка, Начальные объемц слоя/ч при 45/ кетозы, ВЧН определвлась по пересечению линии наименьших квадратов Эффективность определялась с помощью уравнения: Эфф.=ВЧНе 1 а /мМ МЕИГ/футРезультаты этих непрерывных переработок с использованием различных препаратов иммобилизованного энзима 5 10 15 20 глюкозоизомеразы представлены втабл.10.,Приведенные в табл. 10 данные по- казывают, что стабилизированный концентрат энзима может быть эффективно сорбирован ва многих водонерастворимых носителях и может использоваться для непрерывной переработки глюкозы в кукурузную патоку с высоким содержанием фруктозы, Наилучшим использованием энзима было сорбирование стабилизированного концентрата энзима на носителе из регулируемой пористой окиси алюминия. Высокая степень использования энзима является результатом высокой эффективности и длительного полупериода Носители из основного карбоната магния и синтетической энионообмен-. ной смолы, Амберлит ВА, в сочетании со стабилизированнцм концентратом энзима также дали хорошие результаты при экспериментах по непрерывной переработке.Описанная выше процедура в отно" шении носителя из регулируемой пористой окиси алюминия была повторена с использованием стабилизированного концентрата энзима по примеалюминия для обеспечения биокатализатора, который может быть использовандля непрерывной переработки глюкозыв кукурузные патоки с высоким содержанием фруктозы, Высокие связующиеэффективности и длительнце полупериоды делают этот катализатор пригодным для использования в промышленном масштабе,(1 л) е в е е фв Таблица 2 Содержание среды Жидкость для замачивания кукурузы,Код Е 801 Крахмал, Код 30005 2,5 0,2 Ксилоза 1,0 2-я стадия(,14-литровый лабораторный Фермента тор) Лекстроза, Код 2001 Сульфат магния 7 НО Пеноудалитель, НОДАС200 Полипропиленгликоль Жидкость для замочкикукуру , Код ЕЕ 01 Сульфат магния "7 Н 0 Пеноудалитель, НОДАС200 Полипропиленгликоль) Жидкость для замочкикукурузы, Код Е 801 СульФат магния 7 Нф Жидкость для замочкикукурузы, Код Е 801 Декстроза, Код 2001 СульФат магния 78 О Пеноудалитель, НОДАС200(Полипропиленгли-.коль),2600,44.1625,22 130,18 649,991024014 Продолжение табл, 2 Содержание среды Вес кг Глицин 64,86 0,1 Нитрат аммония 130,18 0,2 Сульфат магния 32,66 0,05 Пеноудалитель, НОДАС 200(Полипропиленгликоль) 20,8222,71 л Бикарбонат натрия ае е ее е и ивет ю ее иие е ееиМДобавляется до стерилизации для доведения рН до 5,8-6,0. Конечный объем 18000 галлонов (68137,4 л), Рабочая температура 31 С. е тевте ее ви и те т те еете Таблима 3ееа ат а аетате а Клеточная паста Филъ трат таЕдимичная активносте,НЕИГ/га а Объем, л Единичная ак тивность, НЕИГ/г Вес, кг 1167,2 40,81123,2 42,6 584,3 75,3 578,4 79,1 602,7 84,7 1124, 47.3656,1 69,9 1419;2 40,4 9322010 3200 16,5 1105,6 42,4 587,9. 9,1 16,0 аееаееаеФеаеееее еее таеааееаааеаееаееееееееаееааееее ФФеааФФаф Непрерывное осаадениеИспользует аилвтруаеий материал мФйкэлаатм%МИИспользует материал ндадкелайт Спиделоум. а тв та т аат Разводка ферментатора тететат ев таваееаЗагруз. Объем :Единичная ак каЮ л тивность,НЕИГ/гт ееФв та тетат 6 3190 15,1Изобретение относится к ферментной промышленности и касается получения препарата глюкозоиэомеразы, используемого для переработки глюкозосодержащего сырья во фруктозосодержащие продукты.Переработка глюкозы во Фруктозу (изомеризация) обеспечивает получение продукта, который практически10 представляет собой заменитель торгового сахара, В данном случае исходным продуктом является глюкоза, моносахаридный сахар ( примерно 703 сладости сахарозы), который наполовийу перерабатывается в сахар,с , 15 примерно 110 сладости сахарозы или инвертного сахара. Высокая сладость представляет интерес для получения кукурузной патоки, содержащей Фруктозу. 20При изготовлении кукурузной патоки с высоким содержанием фруктозы энзиматическая изомеризация глюкозы предпочтительно должна производиться на непрерывной основе для того, что бы экономично получать коммерчески пригодную кукурузную патоку с высоким содержанием фруктозы. Обычно глюкозный сироп контактирует с большим количеством препарата изомеразы, который размещается на инертном веществе, например на препарате иммо" билизованного энзима изомеразы глюкозы. Особенностью такого способа является использование препарата им" Мобилизованного энзима изомераэы глюкозы, который обладает высокой концентрацией изомеразной активности на единицу объема, делая энзим пригодным для процесса непрерывной энзиматической изомеризации.Глюкозоимеразу обычно получают внутриклеточным путем, т.е. большая часть энзима изомеразы глюкозы размещается. в пределах и/или на оболоч ках клетки микроорганизмов, из которых его получают, 8 некоторых процессах непрерывной изомеризации предполагается использование целых клеток содержащих изомеразу глюФ50 козы. Такие процессы обычно требуют специальной обработки клеток для предупреждения экстракции изомеразы глюкозы из клеток, так что энзим фактически иммобилизуется в самих клетках, и/или специального. оборудования для решения гидравлических проблем при прохождении содержащего глюкозу раствора через слой клеток, содержащих энзим изомеразы глюкозы 1 1и 1 2.Недостатки способов в которых используются целые клетки, содержащие изомеразу, включают гидравлические проблемы, образование загрязняющих примесей из-за неиаомеразных энзимов, нуклеиновай кислоты и других материалов в оболочках клеток и более длительного времени контакта глюкозного .раствора с препаратом клеточного энзима в щелочных условиях вызывает образование нежелательных продуктов, таких как псикоза и гидроксиметилфурфурол, Это приводит к повышению стоимости производства из-за необходимости рафинирования для удаления образующихся загрязняющих примесей и/или получению низкокачественного продукта.Известны способы, при которых изомеразу глюкозы выделяют из клеток, получают ее в растворимой форме, затем иммобилизуют на водорастворимом инертном носителе. Иммобилизованный энзим становится пригодным для использования в непрерывной переработке глюкозы в кукурузную патоку, содержащую большое количество Фруктозы,Например, известен способ, в кото ром внутриклеточная изомераза глюкозы, полученная из 5 йгер 1 овусеэ зр. АТСС 21175, выращенного на ксилозе и гидрозате ксилана, обрабатывается катионным детергентом, с последующей обработкой диэтиламиноэтилцеллюлозой для удаления примесей. Содержащий изомеразу глюкозы фильтрат затем иммобилизуют на ДЭАЭ целлюлозе или синтетической анионообменной смоле для получения биокатализатора для непрерывной изомеризацииглюкозы во Фруктозу 13Однако способы, основанные на иммобилизации фермента, предусматривают использование выделенной из клеток растворимом глюкозоизомеразы. Способы придания растворимости изомеразе глюкозы известны. Однако необходимо получить не содержащую клеток и растворимую изомеразу глюкозы высокой степени чистоты, которая будет обладать высоким уровнем изомеразной активности на единицу объема. Использование высокоочищенного и концентрированного энзима повышает эффективность, с которой энзим мо,О ся Фе нная нтаци водка 9393,4 2.Изомераэиая активность,МЕИГ/г сухое вещество удельная активность,МЕИГ/г, протеин Сухое вещество,Протеин( Кьельдаль)сухое вещество Нерастворимое суховвещество, Ф на сухое вещество Мд , мг/млМдф+, молярный Мдц/протеин, соотношение Фосфор, Ф, сухоевещество Конечный вес извлеченного стабилизированногоконцентрата энзима,ч,сухое вещество%Клеточная паста Загрузка Н ввввввв Таблица 5 Ьев ввввее вв вв вв в 1270,7 х 10 1240,0 х 10 1178,9 х 1060 10201 Продолжение табл, 5 Осветленныйлизат 875,7 х 10 16200,51 Стабилизированный концентрат энзима тМ"М892,8 х 10 11654 287 58 а аа е аа а аа аааа е а ае+Представляет величины, полученные по разнице или оценочные,Величина дается на сухое вещество,Общая активность осветленного лизата определялась оценкой веса осветленногоИ.3лизата и измерением изомеразной активности в нем; Очевидно, что действительный общий вес выше, чем оценочная величина, так как количество извлеченного стабилизированного концентрата знзима было больше, чем определенное для осветленного лизата. Таблна 6 юю аа аию еюее Загрузка,в течение, нес 105 - 97 98 92 96 96 43 10. 6105 - 03 107 96 103 06 77 46 40 1062 01 10 2 0289,8 00 02 3 3910,7 ф 94 00 01 42441,4 Р 100 105 02 5 5823,7 96 103 07 80 В 76 80 80 39 28 б 88 89 82 84 80 6 1 Ф 91 86 90 86 31 91 6 79609 95 100 105 - 99 100 91 98 97. 44 7 9228,57 95 100 107 - 98 97 89 96 0 62 23 2 8 025 ф 59 101 93 82 85 ВВ 82 83 88 78 5 3 9 7504,6 100 95 88 89 82 83 84 69 586 87 81 86 86 8058 48 42 . 96 90. 10 913,36 9011 11654,0 88 Среднее 96 85 90 - 83 88 - 33 26Это первоначальная величина анализа в начале этого исследования на стабильностьно не первоначальная величина анализа на основе последующих приготовленииэнзина, о чен указывалосв в предыдущих примерах,Началвюная актиеностИЕИГ/гсухое вщество ервоначальнал ионеразная активность, 2 лри хранении лрн тенлвратуре, ЭС с ааю ю ею е ееееа Ее ЕЕ Ее18 26 37 99 100 86 92 90 86 90 8534 1 У 131024014 42 Таблица 7 Светопропускание, Ж, нм Активность во всплываю.нцем слое МЕИГ/мл260 280 рН Соль Вес соли, г Контрольная 1,5 1,19 6,51,53 1,06 6,40 2 79 1,0 1,55 1,08 6,38 3,14 йаС т 2,0 2 76 1,82 13 0 63 5 1,50 103 6,45 йаС 2 5,09 М 950 2,87 0,25 1,48 0,995 645 1 65 1 12 6 30 1,68 1,11 6,25 2,36 0,50 И 950 1, 17 1,0 8950,0,20 М 9504 е фееееееееееееееееееееееее еееВеличина рН в этих испытаниях относительно низкая, что можно отнестиза счет низкой изомеразной активности. Однако недостаточно низкая, чтобыотнести ее за счет почти полной потери изомеразной активности во всплывающем слое при 2,0 еграммовом уровне сульФата магния. Йолагается, чтоувеличение температуры до 35 е 40 С после второго добавления лизоцима былов значительной части причиной дезактивации энзимйой активности в этомэксперименте. Таблица 8 3 по объему добавленной И солиМ Извлеченный энзим Соли Ь1 ОП Соли магния 1 97 100 100 95 М 950 7 Н, 0 Удельная активностьфф 2,4 15,7 15 8 13 6 11 0103 1 03 . 105 МдС 1 15 100 Удельная ак"тивность Мд(СНО ) 16,4 16,9 15,6 9,5 15,4 Одновалентные катионные силн йа 504 Удельная активность43 1024014 Продолжение табл, 8 Извлеченный энзим Соли 2,5ю0 О 0 йаС К О Удельная активность 1,8 1,9 О О 76 ВаС К Удельная активность 8,4 8,8 11,9 104 ЗгС 5 Удельная активность 14 3 12,7 СаС И 19 Удельная активность 8,961 6,2 7,918 СоСД Удельная активность 0,8 5,6 9,1 ИпС В,2 21 Удельная активность.2,6 т ю и е а е и а е е и а е ю ю ю ю е В0,025;. 0,045; 0,08таее еею иттиа аи+Соответствующие молярные концентрации суть 0,01;.при 280/260 нм и указанной в ИЕИГ/мг протеина светоиспусканию Т а б л и ц а 9Носитель Связующая способность Носитель Анионоюобменная смола ИЕИГ/г сухоевеществоИспользованнаяизомераза ет ю ее е е тй 152 БЕС . 333 Буферф" Прочие двухвалентные катионные соли Амберлит 1 КААмберлит 1 ВА4 по объему добавленной 1 И солию5 10 ПредварительнаяобработкаБуфер )сФ.Носитель ФМефавеааеааюайееирьаеайе Предварительная обработ ка Днионо-обменная смола Амберлит 1 ВА"93 Амберлит 1 ЙА"93 Буфер 3 3 Е ДЗАЭ-целлюлоза Селектацель"Ти електацель-Тип 20 Е й 9 електа ип я растворимая изомераза вор, содержащий 0,0 й М ( НО и 0,0001 М Со/С 6 й - нормаль Буферный ра 0,01 М Мо 504 люкозы Н 7,7) буНд,О. из фосфата калия,аблица 10 с Сухое вещество при 2"х полулиниях, МЕИГ/г,ЛСистема неппереработки Зффектив- ность Средняя нагрузка мй ИЕИГ(фут ывн Полурассут/ Пористая окись алюминия с регулируе,29 0 маг ДЗ ле 0,42 0,22 й,б0,49 37,01,13 4,3 4 8 0,49 14 0 шкой, зас мелкимигния, добавй промывке тверстиями и. Затем в ата знзима 18 см с рубрывают сетком ацетата м гают обратно с мелкими ными щарика ого концент АЭ-целлюлоза/се"ктацель8,91 О,й 1,Клетки "Сил-флоу".Мя(ОН) , 2 21 0,44Пористую окись алюминия помещают в колонку 3,0полненной сначала 3 мм стеклянных шариков, накотверстиями, частично заполняют 0,1 М растворляют йй,6 г носителя, после чего, колонку подве. 6,1 И ацетата магния для флюидизации слоя. Сеткпомещают на носителе и покрывают сверху стекляколонку подают 40000-46000 МЕИГ стабилизировани колонку промывают раствором ацетата магния.,0,45 67 91 20,2 26,3 19,6 0,43 60 а1; 1 1в ав е е е Составитель О. СкородумоваРедактор О.Колесникова Техред Т.Маточка Корректор С. Вюкмар а е е еееееевееа еевеееееев веете ееаееа Заказ 4250/52 Тираж 523 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж 35, Рауаская наб д. 4/5в а е ве вт ев еа авфилиал ППП "Патент", г, Ужгород, ул. Проектная, 4 Предложен"ные МЕИГ,мМ, МЕИГ/фут Сорбированные 8 ЕИГ,мМ, МЕИГ/футф Сорбированный знзим,Ф Эффект Полупериод,тив- сутностьжет быть иммобилизован на нерастворимом носителе.Известен способ получения фермент.ного препарата глюкозоизомеразы путем обработки клеток Вас 11 цз соа9 ц 1 апз Нй-б 8 этилендиаминтетрауксусной кислотой, затем лизоцимом в количестве лф 0,01 мг/мг сухого весаклеток с последующим отделением полученного бесклеточного экстракта иобработкой его О,Т М сульфата марганца для получения преципитата нежелательных материалов. Супермагантнесколько раз обрабатывают сульфатом аммония при степени насыщения 150,4-0,45 для.осаждения белковой фрак -ции изомеразы глюкозы, которую затем очищают диализом и хроматографией на диэтиламиноэтил-СефадексеА. Процесс ведут при охлаждении 20(5 С) 4,Недостатком способа является его,ложность, многостадийность, приэтом получаемый продукт не обладаетдостаточно высокой стабильностью и 25выходом по активности (50),Таким образом, остается необ"ходимость в экономичном способе, пригодном для крупномасштабных операций, для получения растворимого иочищенного препарата изомеразы глю-.козы с высоким уровнем активностина единицу объема и высоким уровнем стабильности, пригодного длясвязывания с водонерастворимыми носителями для использования в непрерывных процессах в производствекукурузных паток с, высоким содержанием фруктозы, но также пригодного для других процессов изомеризации.Цель изобретения - упрощениепроцесса, а также повышение активности и стабильности препарата.Укаэанная цель достигается тем,что согласно способу полученияферментного препарата глюкозоизомераэы, предусматривающему обработкубиомассы продуцентаг лизоцимом, отделение бесклеточного экстракта и50выделение из него фермента осаждением, в качестве продуцента используют 5 герйоеусез о 11 чосЬгоеодепез АТСС И 21.713, АТСС Н 21715,биомассу продуцента предварительнообрабатывают водным раствором 2-пропанола при,концентрации последнегов смеси 44-453 мас.4, лизоцим используют в количестве 6,8 ед/мг сухого веса клеток, а осаждение фермента осуществляют сульфатом магния, взятым в количестве 0,02-0,3 М на общий объемсмеси.При этом обычно концентрацию 2- пропанола на всех стадиях процесса поддерживают постоянной и равной 41-43 мас.Ф.Способ проще известного, включаетменьше стадий, может осуществлятьсяпри комнатной температуре, позволяет достичь высокого уровня активности ( 934) при высокой стабильности препарата.Получают водорастворимый стабилизированный концентрат энзима глюкозоизомеразы, состоящий из 1 11 энзимаизомеразы глюкозы, не содержащейклеток, который не содержит нуклеиновой кислоты, и 2 , водораствори" мой соли магния, причем характеризуется следующими константами: содержание протеина 50-803 по весу на сухое вещество; содержанием Мцф+3-45 мг Мд на миллилитр концентрата энзима; соотношение Мц+ протеин 0,02-0,75; удельная изомеразная активность, по крайней мере 10 МЕИГ/мг протеина; стабильность, заключающаяся в том, что он сохраняет до 953 своей первоначальной изомеразной активности при хранении при комнатной температуре(26 С 1 до 30 дней и до 80 + 10 своей первоначальной изомеразной активности при хранениипри 180 С до 12 мес.Концентрат энзима предпочтитель- но содержит смешивающийся с водой органический растворитель, в частности, 2-пропанол, и обладает изомеразной активностьюл 5006-8000 МЕИГ/г на сухое вещество. Способ осуществляется контактированием водной смеси, содержащей энзим изомеразы глюкозы, не содержащей клеток, и смешивающегося с водой органического растворителя с небольшим, но эффективным количеством водорастворимой соли магния (сульфата магния ) для эффективного осаждения энэима изомеразы глюкозы. Эта обработка солью магния вызывает образование преципитата энзима изомеразы глюкозы-магния, который извлекается обычными способами, например центрифугированием. Извлеченный стабилизированный концентрат энзима (который .имеет вид толстого слоя шлама) предпочтительно разбавляют небольшим количеством воды для10240111 1 О 15 Обыцно используют такое количество смешивающегося с водой оргаточно для обеспечения водной смеси по крайней мере 30 вес, и предпочтительно по крайней мере примерно 40 ж по весу относительно смешивающегося с водой органического растворителя, Однако колицество используемого смешивающегося с водой органического растворителя должно быть таким, чтобы значительная цасть неизомеразных протеиновых материалов и нуклеиновых кислот осаждались из раствора до добавления соли, Когда в качестве смешивающегося с водой органицеского растворителя используется 2-пропанол, то водный раствор изомеразы глюкозы, не содержащей клеток, должен содержать 42+1 вес.Ф 2-пропанола.Смешивающийся с водой органический растворитель действует как пре,- дохраняющее средство для энзима во время обработки (и во время хранения, если растворитель не полностью удален ) и уменьшает,растворимость энзима во время добавления соли. Он также действует как осадитель нуклеиновых кислот и других неиэомеразных протеиновых материалов иэ приведенной в состояние растворимости изомеразы глюкозы до обработки сульфатом магния. Способ, которым смешивающийся с водой органический растворитель добавляется в раствор, содержащий изомеразу глюкозы, не содержащую клеток может менятьсяОдин из способов включает первую обработку центрифугированной пасты из,клеток, которая содержит внутриклеточную иэомеразу глюкозы, частью используемого смещивающегося с водой раствори 50 55 б 5 30 3540 45 при комнатной температуре. Смешивающийся с водой органицеский растворитель должен быть растворителем,который уменьшает растворимость протеинов и нулеиновых кислот в водныхрастворах. Типичные водорастворимыеорганические растворители, пригодные для осуществления данного способа, включают метанол этанол,пропанол, 2-пропанол; трет-бутиловый спирт, ацетон, метилацетати парадиоксан, Предпочтительным смеаивающимся с водой органическим растворителем является 2-пропанол нического растворителя, которое доста35" С, наиболее предпочтительно 2530 С. Типичной пригодной солью магния для осаждения является сульфатмагния ( гелтгидратная Форма),Количество водорастворимой солимагния должно быть по крайней мере достаточным для обеспечения получения жидкости, содержащей водный шламсмешивающегося с водой органическогорастворителя и энзим изомеразы глюкозы, не содержащей клеток по крайней мере примерно 0,02 моль по отношению к иону магния. Верхний предел концентрации соли магния изменяется в зависимости от используемой соли. Соль магния не должна добавляться в такой степени, чтобы происходил общий эффект "высаливания" или отделения водносолевой фазы. Максимальное количество соли магния в растворе примерно 0,3 моль Предпочтительно концентрация соли мас. ния в растворе примерно 0,02-0,2 моль, считая на содержание иона магния., Наилучшие результаты получают при добавлении соли магния в количестве, обеспечивающем получение раствора примерно 0,05 по отношению к иону магния.Продуцентами 1 для получения энзимами изомеразы глюкозы, препарата глюкозоизомеразы,является 5 йгерсоаусез,о 1 чосЬговодепез АТСС У 21713 и АТСС М 21715 последний представляет собой простой иэолят колонийЗ 5 АТСС М 21713)15,Ниже приведены определения дляупрощения текста.Выражение "декстрозный элемент"(ДЭ) применяется для обозначения40 снижения содержания сахара в материале, рассчитанного на декстрозу,и выраженного в процентах общегосодержания твердых веществ.Выражение "крахмальный гидроли 45 зат" обычно используется для обозначения сиропа или сухого продукта,который получен гидролизом крахмала.Такой продукт может быть получен,гидролизом в кислой среде или энэи 50 матическим гидролизом или комбина"цией кислотного гидролиза и энзиматического гидролиза. Предпочтительный типа крахмального гидролизата для использования в изомеризации55 в соответствии с данным способом по-лучают кислотным или энзимным раэбавлением до ДЭ 10 или меньше с по"следующим энэиматическим осахарива 7 . 1024014 8 теля, Водный шламм из клеток и раст-ворителя затем обрабатывают такимспособом, чтобы высвободитьизоме.разу из клеток, Такие обработкивключают звуковую обработку, обработку повторным замораживанием иоттаиванием, или обработку поверхностно-активными веществами, и/илилитическими препаратами энзима, та"кими как лиэоцим, Использованиелитических энзимов предпочтительнос точки зрения крупномасштабныхопераций, После высвобождения энзима иэ клеток в раствор добавляют до-.полнительное количество растворителя вплоть до момента, когда про"исходит осаждение нуклеиновых кислот и посторонних протеинов, ноэнзим изомеразы остается растворимым. Затем удаляют остатки клетоки осажденные посторонние материалы,В этот момент производится добавление водорастворимой соли магниясульфата магния с образованием преципитата стабилизированного концент"рата энзима.Другой способ использования растворителя включает добавление всегопредварительно. определенного количества растворителя в клеточную пасту изомеразы глюкозы. Клеточную пасту, получаемую центрифугированиейразводки клеток, содержащей внутриклеточную иэомераэу глюкозы, обрабатывают полным, количеством смешивающегося с водой органического растворителя с водой для получения клеточного шлама из растворителя и воды.Шлам, содержащий смешиваащийся с водой органический растворитель, об"рабатывают для выделения из клетокэнэима изомеразы глюкозы. При последующем удалении нерастворимогоматериала, который содержит остаткиклеток и нуклеиновые кислоты, осветленный раствор, содержащий изомеразу глюкозы, не содержащую клеток, растворитель иводу, обрабатывают. водорастеоримой,солью магния дляосаждения стабилизированного концент- .рата энзима.Условия в отношении температурй ирН во время этой обработки должныбыть такими, что энзим не инактивировался. Обычно рН находится в пределах примерно би предпочтительно7-7,5 во время каждой стадии процесса. Температура может быть примерно 5-55 С, предпочтительно 151 мл 1 мл дкоза 1,И гДистиллированная До получениявода полного объе 50ма 7,5 млПрепарат энзима для анализа сна" чала разбавляется до содержания 1-6 МЕИГ/мл.5Энэиматическая изомеризация производится путем добавления 1 мл препарата энзима в 3 мл исходного раст-Фора и выдерживания в термостате в нием до ДЭ примерно 90, предпочтительно 95.Термин "декстроза" обычно применяется в практике производства для обозначения рафинированного кристаллического сахара ( моносахарида ), т,е. извлеченного из переработанного в высокой степени крахмального гидролизата.-, 10Термин "глюкоза" в контексте при-, меняется как в обычном производст-" венном значении, так и охватывает 1ч моносахаридную декстрозу в любои Фор ме, в растворе или в рафинированной кристаллической Форме.Выражения "Фруктоэа" и "левулоза" обычно применяются как равнозначные для обозначения левовращающегося изомера глюкозы, который слаще декстрозы. Этот изомер обнаружен в натураль ном виде в меде и инвертном. сахаре вместе с глюкозой, и представляет определенную ценность вследствие своей сладости. Выражение "фруктоза" используется для обозначения этого 25 моносахарида, Выражение 1610 (пйег пай 1 опа 1 610 созе 1 зоеегазе Оп 1) является сокращением выражения "Международная единица изомеразы глюкозы" (МЕИГ) . Одна МЕИГ представляет собой количество энзима изомеразы глюкозы, которое образует один микромоль фруктозы в минуту в 0,8 М растворе глюкозы при рН 7,5 и 60 С при использовании методики анализа изомераэ 35 ной активности, Последний включает проведение спектрофотометрического определения кетоэы, полученной иэ раствора глюкозы в стандартной совокупности условий.40Исходный раствор приготовляется следующим образом. Содержание компонентов:0,1 М МдЬО 7.ИО0,01 М СоСР 6 Н 01,0 М фосфатный буфер, рН 7,5 0,5 млБеэво ная О-глютечение 30 мин при 60 С. В конце периода выдержки берут аликвотную долю 1 мл и резко охлаждают в 9-миллилитровом объеме, 0,5 М хлорной кислоты. Охлажденную аликвотную долю затем разбавляют до общего объема 250 мл. Для контроля и сравнения производят также слепую глюкоэную пробу путем замены 1 мл воды 1 мл препарата энзима в форме раствора в начале периода выдержки в термостате. Затем производят определение кетозы методом цистеина и серной кислоты. Для этого МЕИГ определяется как количество энзиматической активности, которое необходимо для получения одного микромоля Фруктозы в минуту в описанных условиях изомериэации.Приготовление энзима лизоэима, Энзим лиэозима ( ЕС 3.2.1.17) представляет собой энэим, который гидролизует бета "1,1- связи между И-ацетил-мурамовой кислотой (или 2"ацетоамидо-деокси-О-глюкозой остатками и 2-ацетамидо-деокси-О-глю. козы в мукополисахариде, мукополипептиде или в хитине), Лизозим обычно получают из яичного белка. Он каталиэирует гидролиз (лизис ) оболочек клеток многих микроорганяэмов.П р и м е р 1 А. Приготовление внутриклеточной изомеразы глюкозы. Препарат энзима внутриклеточной изомеразы глюкозы, используемый для приготовления стабилизированного концентрата энзима, получают в течение четырех стадий развития посева, начиная с 1-литровой встряхивающей колбы и кончая 1000-галонными (3785,1-литровыми) посевными баками и 20000- галлонными(75708-литровыми ) Ферментаторами. На каждой последующей стадии развития и 20000-галонные (75708-литровые) ферментаторы инокулируют с помощью объема посева равного 53 объема инокулированного сосуда. Состав среды для развития посева и рабочих методик приводится в табл,1, Среду для каждой стадиистерилизуют в течение 30 мин при 120 С, Время инокуляционного развития 48 ч для первой стадии, 21 ч для второй стадии; 22 ч для третьей стадии и 15-17 ч для четвертой стадии. На первой стадии клетки из спорового штамма мутанта микроорганизма, определенного как 1 героеусезг имеет 19.5 МЕИГ/мг. Порцию разводки в 2340 галлонов( 8857 9 л) отбирают для использования при приготовлении стабилизированного концентрата изо" меразы глюкозы. Другую порцию разводки извлекают в виде целых клеток с помощью Мд(ОН), вспомогательного фильтрующего материала 511-Г 1 о 332 и 2-пропанола, Извлеченные целые клетки затем используют для энзиматицеской переработки глюкозы во фруктоэу в конверторе периодического действия,Состав среды для развития посева .приведен в табл.1.Состав Среды дл 20000-галонных ( 7508-литровых) ферментатаров при" веден в табл.2. Объем состава1 17000 галлонов 3(64352 л).Б, Приготовление концентрированного концентрата энзима иэомераэы глю козы. 2340-галонную ( 8857,9-литровую порцию разводки энзима внутриклеточной изомеразы глюкозы из 20000-галонного (75708-литрового ферментатора с активностью примерно 19,5 МЕИГ/мл при общей величине 173 х 10 МЕИГ обрабатывают на центЬрифуге, отбрасывающей твердые частицы. "Де Лаваль ВРПХ" Подачу материала на машину производят при скорости 5 галлонов ( 18,9 л) в минуту с 2-минутным циклоном выброса частиц. Промывочную и заливочную во" ду добавляют в течение 1 с до и после выброса из ротора центрифуги.2023 фунта ( 9176 кг ) клеточной пас-ты с активностью 187 МЕИГ/г, полу ценной из ротора центрифуги помещают в 225-галлонный (851,6-литровый) цан с круглым днищем вместе с 7,7 л воды. Когда собирается 650- 700 фунтов (294,8-317,5 кг) клеточной пасты, ее обрабатывают 8 г препарата энзима лизозима (2-х кристаллический, высушенный холодом порошок, приготовленный компанией "Майлс. Сирэвок" из яичного белка с активностью 23000 ед/мг материала) для того, чтобы разрушить оболочки кле". ток и высвободить внутриклеточнуюизомеразу глюкозы в растворимой форме. В клеточную пасту добавляют раствор из 2-пропанола ( 853 по объему) и воды из расчета 5,6 галлона (21,2 л) раствора на 100 фунтов ("3 136 кг) пасты, Дополнительно в смесь добавляют 11 галлонов (41,64 л) 2-пропанола и оды для доведения о 1 чосЬгоаодепез АТСС У 21715, добавляютпитательной среде. Четырестадии развития посева осуществляют.при 28 С и при рН 7,0 (с доведениемдо этой величины.до стерилизации спомощью 10 й гидроокиси натрия). Вовремя второй, третьей и четвертойстадии развития колбы и чаны подвергают продуванию воздухом и перемешиванию в течение ферментаций.1 ОКонечные ферментации проводят в20000-,галонных (75708-литровых ферментаторах) . Ингредиенты среды беэксилозы и декстроэы .единовременнопомещают в 1400 галлонов (52996) конденсата. После приготовления средунагревают примерно до 60 С и доводятрН до 5 6-5 8 с помощью кальциниро-ванной соды 16 Боме. Разводку нагревают, доводя рН для отделения двуокиси углерода,. которая выделяетсяпосле добавления кальцинированнойсоды. После того, как рН среды достигнет нужной величины, добавляютпеноуцалитель и ферментатор и его 25содержимое стерилизуют в течение30 мин при 12 ООС. После стерилиза"ции температуру. среды снижают дос о60 С. Сахары, ксилоза и декстроэа, единовременно помещаются в 4000 гал" ЗОлонов (1514 л) конденсата в 1000,галлонном( 3785-литровый) посевной чан,Сахарный раствор стерилизуют в тече"ние 30 мин при 120 С и после охлаждения сливают по шлангу в 20000-га"лонные(, 75708-литровые) ферментаторы.35После добавления сахара температуру. ферментатора стабилизируют на рабочей величине 32 С, а затем Ферментатор инокулируют посевной культу 40рой. Начиная с 20 ч после инокуля"ции каждые 2 ч отбирают и анализируют на иэомеразную активность, весклеток, уменьшение сахара и всех карбогидратов образцы разводки фермен 45татора. Ферментация считается закон"ценной, когда производство энзимайзомеразы достигает пиковой величи"ны. Во время ферментации рН удерживают 5,4-5,6 автоматически или вруч"ную добавлением газообразного амми"ака через барботажные воздушные,линии ферментатора в условиях предварительной стерилизации.Добавок кобальта не производитсяни на одной стадии ферментации или 5стадии развития посева,Энзим внутриклеточной изомеразыглюкозы, извлеченный из разводки13 10 содержания спирта в жидкости до 30 по объему. Затем смесь, состоящую из пасты, 2-пропанола и воды, перекачивают в 1000-галлонный (3,785-лит" ровый) варочный аппарат и процесс ведут в течение 24 ч. Температуру жидкости в варочном аппарате поддерживают примерно 26 С. После 24"ча сового дигидрирования смесь модифицирована добавлением 85 2-пропанола до содержания 2-пропанола до 523 по объему, где нуклеиновые кислоты нерастворимы, а протеиновый энэимный материал растворим. Роторный вакуум" ный фильтр загружают предварительно . наносимым Фильтровальным материалом "Дайкзлайт 4200" в количестве 200 фунтов (90,7 кг), Когда предварительнонанесен слой Фильтрующего материала, то в воду предварительного слоя добавляют 2-пропанол для доведения содержания спирта примерно до 523 по объему с тем, чтобы снова удерживать нуклеиновые кислоты в нерастворимой форме, т.е. для предупреждения приборостроения растворимости нуклеиновыми кислотами. 8 роторном фильтре с предварительно нанесенным слоем Фильтрующего материала не осу" ществляют никакой промывки, но пред варительно нанесенный слой смеси во" да - спирт пропускают через фильтр после окончания фильтрации шлама пас. ты, Влам пасты, оставшийся в слое предварительно нанесенного Фильтрую- щего материала, перекачивают на нутч" фильтр для удержания на минимальной величине потерь энзима, Производят добавление фильтрующего материала"Дайкелайт. 4200", чтобы способство-. вать фильтрации на нутч-фильтре.фильтрат из обоих фильтров;роторного фильтра к предварительно нанесенным слоем Фильтрующего материала и нутч-фильтра перекачивают в 1000 галонный379-литровый ) чан, используемый в качестве хранилищной емкости для подачи в питательный чан, куда добавляют 15 галлонов (56,78 л)1,0 раствора малярного сульфата аммония (И (МН,)04 7 Н О) и 13 галлонов (49,2 л) 85 по объему 2-пропа"нала. Смесь подают на центрифугу."Де Лаваль БРПХ".при расходе,подачи 16,6 галлонов (62;8 л в минуту при 5-минутном цикле выброса.После окончания центрифугирования ротор пять раз прочищают 1-секундным добавлением заливочной воды и прокручивают. Остаток, содержащийстабилизированный концентрат знзима,оставшийся в роторе и выбрасывающейкамере, счищают и ротор и камеру промывают некоторым. количеством легкойФазы, выгруженной иэ центрифуги. Остаток и промывочная жидкость переходят в продукт - стабилизированныйконцентрат знэима. Продукт перемешивают с,помощью лабораторной мешалки и помещают в 1-галонные ( 3785-литровые) пластиковые контейнеры дляоценки и дальнейшего использованиядля знзиматического преобразованияглюкозы во Фруктозу.Общий выход стабилизированногоконцентрата знэима изомераэы глюкозы(загрузка Ю) 11 галлонов(11,61 лв виде концентрированной жидкости, содержащей 109 х 10 МЕИГ или примерно11,261 ИЕИГ/г на сухое вещество, Этосоставляет 63 извлечение общей активности, присутствующей в разводкецелых клеток, использовавшейся в качестве исходного материала, болееполный анализ стабилизированногоконцентрата знзима изомераэы глюкозыприводится ниже,Загрузка У 1Изомеразная активностьИЕИГ/г, сухое вещество 11,261 Удельная активность,ИЕИГ/г,протеин Сухое вею;атство,Ж8 лажность(Карл Фишер),3Протеин(,Къельдаль),Фна сухое веществоВольная окись, 4 насухое вещество Нерастворимое, сухое вещество, 4 на сухой основеМял, мг/мл Ия/протеин,соот- ношение 14П р и м е р 2, Несколько загрузок знзима внутриклеточной изомеРазы глюкозы, полученного из бгерйошусез о 1(чосЬгоцепез АТСС Ю 21715 1 приготавливают как в примере 1( А ) с использованием 7,5-литрового, 40- литрового и 400-литрового ферментаторов для развития посевов и в4000-литровом ферментаторе дляокончательной стадии выращивания, После ферментации температуру каждой из загруэок, содержащей целые клетки 5 энзима внутриклеточной изомеразы глюкозы, снижают с 32 до 22 С для задержки дальнейшего роста микробов и возможного автолиза клеток, Загрузки разводки затем подвергаютцентрифугированию для концентрирования клеток с целью образования кле. точной пасты. Тяжелофазную клеточную пасту собирают в 10-галлонных ( 37,8-литровых ) емкостях, взвеши вают и затем перекачивают в 1000-галлонный ( 3785-литровый) варочный чан для дигерирования клеток. В клеточную пасту добавляют при перемешивании препарат энзима (2-х кристалличес 20 кий высушенный вымораживанием порошок, изготовляемый компанией "МайлсСирэйвок" из яичного белка и имеющий активность 23300 ед/мг материала (для дигерированияоболочек клеток 25 и высобождения внутриклеточной изомеразы глюкозы в растворимой форме.Дозировка лизоцима для каждой из загрузок 6,8 ед/мг клеток (на сухое вещество). Общий вес клеток (на сухое вещество), присутствующих в клеточной пасте, рассчитывают с использованием конечного веса сухих клеток всей разводки Ферментатора и обьема разводки Ферментатора. Это предполагает 1004-ное извлечение клео35 ток на сухое вещество на стадии начальной концентрации, Лизоцин добавляют в клеточную пасту после центриФугирования всей целой разводки и40 перед добавлением какого-либо спирта к клеточной пасте. После добавления лизоцима добавляют 2-пропанол для получения концентрации 42+13 по весу. Первоначальное добавление 2-пропанола рассчитывается на основе веса45 клеточной пасты минус 8 на нерастворимые вещества ( на сухой вес) и свойства подаваемого спирта.В четырех загрузках осаждение производят периодически с использованием питающего чана для отстойника. Осветленные Фильтраты периодически помещают в чан (в каждом опыте) объемом примерно 170 галлонов (633,45 л ). К этому добавляют 1,0 М раствор Мд 505 при дозировке 0,05 галлона 0,189 л) на галлон (3,785 л) осветленного лизата и обьем азеотропического 2-пропанола для поддержания общего уровняпропанола примерно 421 по весу, Вовремя добавления растворы перемеши-,;вают и,рециркулируют питательным насосом для облегчения перемешивания. Осажденный энзим выдерживают в течение 10-15 мин, чтобы дать ему агломерироваться в крупные хлопья, а за-, тем извлекают центрифугированием с использованием центрифуги "Де Лаваль БРПХ", Раствор подают на центрифугу при расходе подачи 6-10 г/мин.В одной загрузке ( загрузка И 10) осаждение проводят непрерывно с использованием питательного чана в качестве реактора с непрерывным пере"мешиванием. Осветленный лиэат и раствор М 9504 непрерывно подают дозой впитатель через смесительный тройник.Концентрацию 2-пропанола осветленноголизата доводят до 44".-453 по весудля компенсации при растворении раствором М 950,т.е. поддерживая во время осаждения содержание спирта 4 Ьь 13. Поток осветленного лизата регулируютс помощью регулятора расхода. 1 М ра;створ М 9504 подают при расходе подачи 0,05 галлона (0,189 л) на галлон (3,785 л) осветленного лизата с использованием для этого небольшого диафрагменного насосаОсуществляют перекачку обоих растворов и в питательном чане создают нужный уровень.После окончания центрифугирования соответствующих загрузок остаточный энзим удаляют с поверхности центрифуги дистиллированной водой и смешивают с продуктом стабилизированнымконцентратом энзима. Каждую из извлеченных эагрузок стабилизированного концентрата энзима перемешивают до гомогенной, разливают в бутылки и хранят при 4 ОС,В табл, 3 и 4 приводятся данныеоб эффективности извлечения энзима накаждой стадии процесса. В табл.4 приводится анализ стабилизированных концентратов энзима.П р и м е р 3, Загрузку энзима внутриклеточной изомеразыглюкозы, полученного из 5 йгерсоаусез о 1 чосй- гово 9 епез АТСС Г" 21715, приготавливают по примеру 1(А ) с использованием 1-литрового, 14-литрового, 50-галонного (189-литрового) и 1000" галонного (3785-литрового) фермента- . торов для высевки и развития посеваи 20000-галлонного (75708-литрового/ ферментатора 1 ля окончательной ста