Способ определения активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в эритроцитах

ОЮЗ СОВКТСНИ ОЦИАЛИСТИЧЕСН РЕСПУБЛИК) 4 С 01 11 33/6 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ глфьд.:. : 1 л- 14 Бюл, В 39государственный медита, Э. В. Калиничева8)Р.П. Дегидрогенази-нитротетразолиякн.; Н.С.Кисляк,етки крови у детейогни, - М.: Иедици(57) Изобретение о не, а именно к гем ИВНОСТЗЫ В тносится к медй атологии, и мож ОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(56) Нарциссовс применениемфиолетового. /ВР.В,Ленская. Клв норме и патолна, 1978, с. 14 быть применено для диагностики гемолитических анемий и оценки метаболиз.ма эритроцитов. Цель изобретенияповышение точности способа. У пациента берут кровь, смешивают с инкубационной средой, содержащей дополнительно хлористый магний, гепарин,метиленовую синь. Инкубируют смесьпри 37 ОС. 30 мин. Затем делают мазок,высушивают и микроскопируют (окулярх 10; объектив х 90). При этом подсчитывают общее количество гранул формазана в 200 эритроцнтах. Определяютсреднее содержание гранул в одномэритроците, что и является показателями активности фермента. При средней концентрации гранул 3-5 констати.руют сниженную, 7-9 - нормальную,10-14 - повышенную активность фермен.та. 1 табл.65614 Изобретение относится к области медицины, а именно к гематологии, и может быть использовано клинико-диаг. ностическпми и наУчно-исследовательскими лабораториями для диагностики ;гемолитическиханемий и оценки метаболизма эритроцитов.Цель изобретения - повышение точности способа за счет исключения ингибирования Фермента фиксацией и добавления в инкубационную среду дополнительно хлористого магния, гепарина и метиленовой сини, проведения инкубации непосредственно с пробой крови, приготовления мазков и подсчета в них среднего числа гранул формазана в одном эритроците.Способ осуществляют следующим .образом.Из пальца пациента берут 0,05 мкл .крови и смешивают с 0,1 мкл инкубационной среды в центрифужной пробирке, которая предварительно нагрета до 37 С. Состав инкубационной среды приведен, в таблице. Кровь инкубируют в термостате прио37 С в течение 30 мин, предварительно тщательно и осторожно перешав синкубационной средой. По истечениисрока инкубации делают мазок, высушивают и микроскопируют (Окуляр х 10;объектив х 90). При микроскопии мазков подсчитывают общее количествогранул формазана в 200 эритроцитахи определяют среднее содержание гранул в одном эритроците, что и является показателем активности Фермента.Разработаны критерии для оценкиактивности Г-б-ФДГ при использовании предлагаемого способа: при средней концентрации гранул от 3 до 5констатируют сниженную, от 7 до 9 -нормальную, от 10 до 14 - повышеннуюактивность фермента,П р и и е р 1, Больной М 32 го, да, поступил с диагнозом: острая лекарственная гемолитическая анемия,С 15-летного возраста страдает приступами острого гемолиза, связаннымис приемами анальгина. Антибиотикигемолитических кризов не дают.Анализ кропи: гемоглобилин 73,0 г/лэритроциты 2250000, ц.п, = 0,95;ретпкулоциты2% (45 тыс./мкл). Содержание непрямого билпрубипа в сывогротке крови 45 мкмоль/л. РеакцияКумбса отрицательная,Для выяснения причины гемолизаэритроцитов проведено определениеактивности Г-ФДГ по предлагаемомуспособу. У обследуемого больного общее количество гранул в 200 эритроцитахсоставило 631. Следовательно, активность Г-ФДГ составляет 3,15, чтосвидетельствует о низком уровне активности Фермента, обусловившем острый гемолиз эритроцитов после приема анальгетиков.П р и м е р 2, Больная Р, 40 лет,поступила с диагнозом: гемолитическая анемия.Анализ крови: гемоглобин 50 г/л;эритроциты 1600000; ц.п. = 0,9;ретикулоциты 1,2% (19,2 тыс/мкл). Вмиелограмме содержание эритроидныхклеток 45%. Содержание непрямогобилирубина в сыворотке крови составд ляет 14 мкмоль/л, прямого нет.%С целью исключения гемолитическойанемии, обусловленной недостаточнойактивностью глюкозо-фосфатдегидрогеназы эритроцитов, проведено определение активности данного ферментапо предлагаемому способу,У обследуемой больной общее количество гранул в 200 эритроцитахсоставило 1566. Таким образом, актив 35ность глюкозо-Фосфатдегидрогеназысоставляет 7,83, что соответствуетнормальному уровню и позволяет исключить дефицит Фермента как причину гемолиза эритроцитов,П р и м е р 3. Больной Б. 35 лет, поступил с диагнозом; гемолитическая анемия .Анализ крови: гемоглобин 87 г/л; эритроциты 2900000; ц.п. = 0,9; ретикулоциты 20% (580 тыс/мкл). Содержание непрямого билирубина в сыворотке крови 37 мкмоль/л, реакция Кумбса отрицательная, В мазке крови выражен микроцитоз. Осмотическая резистентность эритроцитов снижена, При объективном исследовании больного обнаружено увеличение селезенки.При .определении активности глюкозо.-6-фосфатдегидрогеназы по предлагае-, мому способу обнаружены высокие показатели: 12,8, что позволяет исключить энзимопенический вариант гемолитической анемии и подтверждает диагноз:1265614 ты Количество вещества,растворенного в10 мл физиологического раствора, мг Количество раствора,используемого наодно исследование,мкл Ингре люкозофосфатдинаиевая соль АДФ 0,01 0,0 и-Нитротетразолий фиолетовыйорректор Л Патай Редактор Н.Яцола Заказ 5655/ 718твенного комретений и отЖ, Раушска Подписнотета СССРрытийнаб., д. 4/5 Тираж ВНИИПИ Государ по делам изо 3035, Москва, Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул, Проектная, 4 наследственная микрофероцитарная гемолитическая анемия. Формула изобретения5 Способ определения активности глюкоз о-фо сфатде гидро ген азы в эритроцитах путем исследования ее цито- химическим методом с использованием инкубационной среды, содержащей и нитротетразолий фиолетовый, трис-буфер рН = 8,0, глюкозо-б-фосфатдинатриевую соль и НАДФ при физиологических условиях, отлич ающийс я тем, что, с целью повышенияточности за счет исключения ингибирования фермента фиксацией, инкубационная среда дополнительно содержит хлористый магний, гепарин иметиленовую синь, а инкубацию проводят непосредственно с пробой крови, далее готовят мазки и определяютчисло гранул образовавшегося формазанав одном эритроците и по среднейвеличине этого показателя определяют актиВность фермента.