Способ получения глицеральдегидфосфатдегидрогеназы из скелетной мышцы млекопитающих

(23)Приоритет 5)М. Кл. С 01 К 33/48 3 Ъсударствапак кеинте СССР а делам наебретений н еткрытнй, Н. Гильмиярова, Н,к а и "Я -Ю,В 4 Ьхаена 9 Ф 4 уйбышевский медицинский инстит им.иД И;Улъ) Заявитель Ц СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НИЦЕРАЛЬДЕФИДФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗ ИЗ СКЕЛЕТНОЙ ИЬИИЦЫ ИЛЕКОПИТА 10 ЩИХ Изобретение относится к медицийе,и может быть использовано для полу-,чения глицеральдегидфосфатдепидроге-.назы из скелетной мышцы млекопитающих.Известен способ получения глицеральдегидфосфатдегидрогеназы из скелетной мышцы млекопитающих путем еегомогенизации с последующей экстракцией белков раствором фосфатнокисло 1го калия, постепенного повышения насыщенности экстракта сульфатом аммония и отделения балластных белков 11.Однако известный способ не позволяет получить фермент в высокоочищенном виде,Цель изобретения - повышение чисттоты фермента и выделение его в крис"таллическом виде,Указанная цель достигается тем,что при осуществлении способа получения глицеральдегидфосфатдегидрогеназы из скелетной мышцы млекопиющих пу.тем ее гомогенизации с последующей экстракцией белков раствором фосфорнокислого калия, постепенного повышения насыщенности экстракта сульфатом аммония и отделения балластных белков, насыщение экстракта доводят до 0,68 и выдерживают его при комнатной температре до получения кристаллов фермента.Способ осуществляется следующим образом.Иышечную ткань при посмертной биопсии рсвобождают от жировой, сое" динительной ткани, гомогенизируют, взвешивают, добавляют 0,03 Н раствор К 2 НРб,.в соотношении 1:2, экстрагируат на холод в течение 60 мин при периодическом перемешивании, затем отжимают, плотный остаток мышщ отбрасывают.К экстракту добавляют мелкодис персный порошок сульфата аммония из расчета 39,6 г на 100 мл экстрактаСульфат .аммония добавляют небольшими порциями при тщательном перемеши-,930124Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Гулый. М. Ф., Дворникова П, Д Коламийченко М, А. и Попадюк Е. Я. Метод Фракционирования и кристаллизациии мышечных белков.-"Вопросы биохимии мышц", Киев, 1954, с, 244-276. филиал ППП "Патент", г. 3,вании. Оставляют на 15 мин, затем Фильтруют. Осадок отбрасывают.Фильтрат насыщают от 0,55 до 0,68 путем добавления сульфата аммония из расцета 9,36 г на 100 мл фильтрата, 5 Образовавшийся осадок отбрасывают фильтрованием при комнатной температуре.ЬКристаллизация начинается через 12 ц, в фильтрате образуются единиц ные кристаллы глицеральдегидфрсфатдег. гидрогеназы в виде длинных тонких палочек, располагающихся отдельно, При дальнейшей кристаллизации палочки собираются с образованием "снопов". 5 Кристаллизация заканчивается на 2- 3 сут.Перекристаллизацию проводят через 3-4 сут, позже возможно появление кристаллов миоглобина. Кристаллы отделяют путем центрифугирования при 12000-15000 об/мин в рефрижераторной центрифуге в течение 15 мин. Осадок растворяют в минимальном количестве охлажденной бидистилированной воды (2-3 мл). Раствор фильтруют (через ватный фильтр), затем добавляют равный объем насыщенного раствора сульФата аммония с рН 5,7-5,8, Кристаллизуют при комнатной температуре в течение 2-3 сут. Кристаллы хранят при 0-4 оП р и м е р. Протокол выделения глицеральдегидфосфатдегидрогеназы (К. Ф. 1.2. 12) из скелетной мышцы чеИсследуемый К. 1958 года рождения.Время смерти:17 декабря 1979 г,22 ч,Время взятия мышечной ткани: 18 де кабря 1979 г, 12,00 ч.Причина смерти: смерть наступила щ ,от оскольчатого перелома костей свода и основания черепа1-й этап.Полуцают 193 г мышечного гомогената, добавляют 386 мл 0,03 М раствора 4 из расчета КНРО+ (1:2). Экстрагируют 60 мин.Отжимают 240 мл экстакта, добавляют 95,04 г и фильтруют через складча-тый фильтр на ночь.К 215 мл фильтрата добавляют 20,124 г сульфата аммония осадок вновь отделяют фильтрованием. Фильтрат оставляют при комнатной температуре для кристаллизации Фермента. ВНИИПИ Заказ 3457/56 4Кристаллизация нацалась через 3 ч. Кристаллы в виде длинных, тонких пало. чек, располагаются беспорядочно, но встречаются пучки - скопления. Закончилась кристаллизация через 3 сут.2-й этапСпустя 2 сут, первичные кристаллы отделяют при 15000 об/мин в течение 15 мин, Осадок растворяют в небольшом количестве охлажденной бидистиллированной воды, затем добавляют равный объем насыщенного раствора сульфата аммония., Оставляют при комнатной температуре, Кристаллизация закончилась через 3 сут.Активность глицеральдегифосфатдегидрогеназы определялась спектрофотометрически в реакционной среде следующего состава: трис-солянокислый буфер 4,4 ф 10 М рН 8,62; смесь фосфотриоз, получаемая нами ферментативным путем по методу О. Мейергофа (1938) 1,0 фМ НАД 1,2 10М; арсенал натрия 5 10 .М.Пересчет ведут на белок, количество которого определяют биуретовым методом и спектрофотометрицески.Практическая ценность предлагаемого способа заключается в том, что он позволяет выделить Фермент не только в высокоочищенном, но и в кристаллическом виде с сохраненной функциональной активностью.Формула изобретенияСпособ получения глицеральдегидфосфатдегидрогеназы из скелетной мышцы млекопитающих путем ее гомогенизации с последующей экстракцией белков раствором фосфорнокислого калия, постепенного повышения насыщенности экстракта сульфатом аммония и отделе ния балластных белков, о т л ич а ю щ и й с я.тем, что., с целью повышения чистоты фермента и выделения его в кристаллическом виде, насыщение экстркта доводят до 0,68 и выдерживают его при комнатной темпе ратуре до получения кристаллов фермента. Тираж 883 Подписное Ужгород, ул. Проектная, 4