Способ электрофоретического разделения саркоплазматических и миофибриллярных белков скелетных мышц животных

ОП ИСАНИЕ 496045ИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДНЕЛЬЮВУ Союз СоватснинСоциалистицвскинУесвубпик 61)Дополнительное к авт. свид-в(22) Заявлено 29.10,73 (2 1973206/28-13 51) М. Кл. В 011 5/0 с присоединением заявкиГосударственный комнтет Соната 1 йнннстраа СССР аа делам нзаарвтеннй н аткрытнй(1 Заявител Всесоюзный научно-исследовательский институ холодильной промышленности Изобретение может быть широко применено при аналитических работах по оценкепищевой ценности продукта в мясной промышленности, а также в других отрасляхпромышленности при проведении исследова- ательских работ,Известен способ электрофоретическогоразделения белков скелетных мышц животных, например саркоплазматических и миофибриллярных, в крахмальном геле, предус 10матриваюший приготовление крахмальногогеля, его охлаждение и разделение белковметодом электрофореза,Однако из-за недостаточного охлаждения 1 Ькрахмального геля происходит резкое повы-шение температуры в процессе электрофореза, в результате чего создаются условия,которые приводят к значительной денатура- ;ции саркоплазматических и миофибриллярных 20белков при их электрофоретическом разделе-.нии, что, естественно, искажает белковуюкартину исследуемого препарата.Целью изобретения является предотврашение денатураций белков в крахмальном 25 геле в процессе их разделения и промерзания геля.Это достигается тем, что электрофорез проводят в крахмальном геле при температуре преимушественно фф-ф 6 С с одновременным охлаждением геля хладоносителем, например этиловым спиртом или фреоном при температуре от -5 до -55 С,При этом разделение саркоплазматических белков в процессе электрофореза осу шествляют при температуре хладочосителя от -5 до -ф 5 оС, миофибриллярных - от -30 до -55 оС.Предлагаемый способ исследования белка мышечной ткани животных осуществлен в лаборатории биохимических исследований ВНИХИ на скелетных мышцах быка, свиньи и- овцы.Гель для разделения саркоплазматическихи миофибриллярных белков готовят в соот, ветствии с методикой, приведенной ниже.К ф 3 г частично гидролизованного крах-мала добавляют ф 50 мл трис-боратного бу фера (90% смеси 0,0033 М лимонной кислоты и 0,016 М триса; 10% смеси О,ОфМ(54) СПОСОБ ЭЛЕКТРОфОРЕТИЧЕСКОГО РАЗДЕЛЕНИЯ САРКОПЛАЗМАТИЧЕСКИХ И МИОФИБРИЛЛЯРНЫХ БЕЛКОВ СКЕЛЕТНЪХ МЫШЦ ЖИВОТНЪХ, 3гидрата окиси лития и 0,076 М борной киспотьц рН 8,5), содержащего 1 М моче вины (фракционирование саркоплаэматических белков); к 24,5 г крахмала добавляют 220 мл трио-боратного буфера, содержащего 4 М,юочевины (фракционирование миофибриллирных белков). Полученный гель за ливают в кювету иэ плексигласа (270 х х 110 х 6 мм), толщина днища которого составляет 5 мм, 10Для применения способа электрофоретического разделения белков скелетных мышц животных целесообразны и другие известные буферные системы,Саркоплаэматические белки растворяют р в трис-боратном буфере, содержащем сахароэу, а миофибриглярные белки - в 8 Ммочевине из расчета 3-4 мг на полоску хроматографической бумаги (3-10 мм), которую затем вставляют в гелевую пластину. 20Разделение белков проводят при силе тока 25-30 ра, напряжения 800-1100 в ,в течение 2,0-3,5 час.Для обнаружения белков на протеинограмме гель выдерживают в растворе ниг-, % розина.Денситометрирование протеинограмм проводят на микрофотометре Мфс записью сигнала на автоматическом потенци метре ЭПП, ЗОДля эффективного охлаждения крахмального геля по предлагаемому способу электрофореза в качестве хладоносителя применяют этиловый спирт или фреон - 30, хлад- агентом является смесь сухого льда и спир-Зь та, загружаемая в малый котел ультратермостата. При этом хладоноситель поступает в охлаждающий столик (270 х 11 0 х х 25 мм) из плексигласа, .охлаждающая по 40 Саркоплазматические белки, см2 4верхность которого является одновременно дном кюветы, используемой для приготов, ,ления крахмального геля. Необходимая теЫ . пература крахмального геля (22 26 оС и хладоноситела от -,5 до -25 о и от -30 до -55 оС) для разделения соответственно сар коплазматических и миофибриллярных бел- . ков поддерживается ультратермостатом (например марки Иили И, ГДР),Температуру крахмального геля в процессе электрофореза определяют хромелькопелевой термопарой с помощью потенциометра ПП(класс 0,5) с внешним гальванометром М 195/2.Большое число и содержание отдельных белковых фракций как при разделении саркоплазматических белков, так и миофибрилляр, ных выявляется при использовании хладоно: сителя с .дифференцированной отрицательной температурой. Значительно меньшее количество и число белковых фракций выявляется при электрофорезе в крахмальном геле, охлаждаемом льдом. Этот вывод подтверждается результата ми денситометрирования протеинограмм, приведенными в таблице. Из нее следует, что сумма плошадей пиков саркоплазматических белков, разделенных при использьвании хладоносителя с температурой от -5 до -25 оС, превышает почти в 1,6 раз плошадь пиков, полученную при разделениибелков с использованием льда. Еше большееразличие наблюдается при разделении миофибриллярных белков. Так при использовании предложенного способа (температурахладоносителя от -30 до -55 оС н температура крахмального геля 23 оо) плошадьпиков возрастает в 1,8 раз. Мнофибрнллярные белки, см 2496048 16 2,50 2,60 0,93 0,53 3,48 0,68 4,08 0,65 Итого 50,61 32,75 18,19 81,98 ф ормула из обретения 1. Способ електрофоретического разде пения саркоплазматических и миофибрилляр ных белков скелетных мышц животных в крахмальном ген, предусматриваюший при готовление крахмального геля, его охлаж- "ф дение и разделение белков методом элек трофореза, о т л и ч а ю ш и й с я тем, что, с целью предотвращения тепловой денатурации белков в крахмальном геле в про- цессе их разделения и промерзания геля, ф электрофорез проводят в крахмальном геле при температуре преимушественно 22-26 оССоставмтель МЛарина Техред И.Карандашова Корректор Т.Гревцова Редактор А.БерЗаказ 6 фУ тираж Изд. М ф 5/ Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий Москва, 113035, Раушская наб., 4 Предприятие Патент, Москва, Г, бережковская наб., 24 2,25 5,46 3,88 2,20 2,73 5,27 1,34 1,26 5,6 Р 1,38 1,00 1,30 8,05 0,75 0,84 0,12 0,20 0,12 0,24 4,13 Р,26 7,8 П 2,98 2,14 8,47 2,52 1,82 8,97 1,78 1,42 2 э 13 13,30 .0,90 0,99 0,16 0,16 0,24 0,24 0,17 0,16 с одновременным охлаждением геля хладоносителем, например атиловым спиртом или фреоном - 30 при температуре от -5 до -55 оС,2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю ш и йс я тем, что разделение саркоплазматиче -.ских белков в процессе электрофореза осуществляют при температуре хладоносителя от -5 до -250 С3. Способ по п. 1, о т л и ч а ю ш и йс я тем, что разделение миофибриллярныхбелков в процессе электрофореза проводят при температуре хладоносителя от -30 дл -55 оС.