Способ получения рибонуклеозид-5-трифосфатов

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Своз СоветскихСоциалистическихРесвублик(23) Приоритет ударстаеиаыа каеятет СССР делам нзобретенай н открыта а.07(088.8), убликовано 15,10.79 Бюллетень М 38 Дата опубликова исания 15.1 0.79 72) Авторы изобретен В. А, Коржов,.Н.Загреб(71 Заявитель ро пециальное конс биологичес(54 ) СПОСО диэстеразы иэ т гидролиэа,смесь рибонукв, разделяют графией нат индивидуальмонофосфаты. Вымонофосфатов на бонуклеиновой 5-50, относиод целевого проя стадия процесе - протекает од целевого просоставляет 38 на 20 1Изобретение относится к усовершенствованному способу получениярибонуклеоэид-трифосфатов, кото/рые широко используются в биохимических исследованиях, а также вмедицине,.Известен способ получения рибонуклеозид-трифосфатов путем ферментативного синтеза на .основесоответствующих рибонуклеозид-монофосфатов, трис-НС 6 буфера,рН 7,5 в присутствии ионов Иа+,креатинфосфата, аденоэинтрифосфата, очищенной креатинкинаэы, выделенной из мьтац кролика, очищенных 15нуклеотидкиназ, выделенных из Еэсйе 1 ЧСИа Сот, т 5 (Е.соЕ 1 3). Процесс проводятпри 37 ф С в течение 20 мин, про-.дукт выделяют хроматографически,выход продукта 85 в расчетеисходный реагентНедостатками известного способаявляютсяиспользование в качестве исходныхсубстратов для синтеза рибонуклеозид-трифосфатов соответствующихрибонуклеозид-монофосфатов, котбрые получают ферментативным гидролизом рибонуклеиновой кислоты с ис"пользованием очищенной 5-эндонуклеа зы и очищенной фосфо змеиного яда. Продук представляющий собой леоэид-монофосфато ионообменной хромато ДЬУЭКС 1 х 2 и выделяюные рибонуклеоэидФ ход рибонуклеозид- стадии гидролиэа ри кислоты составляет 4 тельно невысокий вых дукта, так как втора са - фосфорилировани с выходом 85, а вых дукта за две стадии 43использование в синтезе очищенных нуклеоэидкиназ из Е.сот,1 и очищенной креатинкиназы из мышц кролика; использование в качестве донора фосфорильных групп креатинфосфата.Целью изобретения является упрощение способа получения и повышение выхода рибонуклеозид-трифосфатов, Поставленная цель достигается использованием в качестве исходного субстрата рибонуклеиновой кислоты; в качестве ферментного препарата - цельного нефракционированного экстракта из. со 63;в качестве макроэргичес)691462 Составитель Л,НикулинаРедактор Н,Потапова Техред С.Мигай КорректорИ.Михеева Заказ 6144/19 Тираж 513,. Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 1130 35, Москва, Ж, Раушская наб., д.4/5филиал ППППатент , г,ужгород, ул.Проектная,4 кого соединения - ацетилфосфата,получаемого простым химическим споссбом,Процесс проводят в присутствии фосфата натрия при рН 7,8-8,2 в течение 4-5 ч, что позволяет упроститьпроцесс (исключить трудоемкие стадииочистки ферментов-нуклеотидкинаэ из Е.со 64 В и креатинкиназы) и повыситьвыход целевого продукта на исходнуюрибонуклеиновую кислоту до 85-90.П р и м е р .Приготовление ферментного препарата 50 г клеток Р. со 61 В суспендируют в 150 мл 0,5 М трис-НС 8буфера (рН 7,5) и разрушают ультразвуком на ультразвуковом генераторес частотой 180,4 кГц в течение 15 мин,Сусцензию центрифугируют в течение20 мин при 12 000 об/мин и 4 С. Осадок отбрасывают, а супернатант используют в качестве ферментного препарата. Концентрация белка в препарате 2014 мг/ил.ферментный препарат хранят при/Получение нуклеозид-трифосфатов.Готовят путем смешения реакционную смесь (500 мл), содержащую 2 грибонуклеиновой кислоты и следующиекомпоненты, мкмоль/мл", ацетилфосфат210, Мо +15, фосфат натрия (аНгР 04)200, трис-НСЯ (рН 7,5) 40, Ферментный препарат 7 Мг/мл (по белку).Смесь термостатируют в течение 5 чпри 37 С,Реакцию останавливают доббавлением к реакционной смеси равного объема охлажденной до 0 С 10-ной 35НС 604. Осадок удаляют центрифугированием. В супернатанте определяютстепень расщепления рибонуклеиновой кислоты йо приращению оптическойплотности при 260 нм кислоторастворимой Фракции. Степень расщеплениярибонуклеиновой кислоты достигает90. Супернатант титруют растворомКОН до рН 7,0 и выпавший осадокперхлората калия удаляют фильтрованием. фильтрат хроматографируют на 45анионообменной смоле Пауэкс 1 х 2,элюируя ступенчато 0,05 М Ь 1 С 1 в0,003 н,НСЯ (нуклеозид-дифосфаты)у0,1 М УС 6 в 0,003 н.НСР (цитоэин-трифосфат); 0,15 М 11 С 0 в 500,003 н.НСЬ (аденозин-трифосфат);Ор 2 Л 41 СЕ в 0,02 М формиате аммония (уридин-трифосфат) и О, З,М Ь 1 СГ в О, 003 н. НСС (гуанозин- -трифосфат) . Фракции элюата, содержащие соответственно цитозин-три/фосфат, аденозин-трифосфат, уридин-трифосфат, гуанозин-трифосфат собирают раздельно, нейтрализуют и осаждают в виде литиевых солейОохлажденной до -10 С смесью метанола и ацетона (1:10), Осадки собираЮт центрифугированием и лиофильно высушивают и характеризуют.Спектральные характеристики Ц 2 Го/Дгбо Дг 8 О/Д гбо 1 г 9 о/)(гьо каж дого нуклеозид-трифосфата соответствуют стандартным для данного соединения, Содержание основйого вещества в каждом рибонуклеозид- трифосфате 90-95, Содержащаяся в препарате примесь - хлористый литий.Предлагаемый способ получения нуклеоэид-трифосфатовиз рибонуклеиновой кислоты позволяет упростить процесс, повысить выход продуктов в 2 раза, не требует применения дорогостоящих ферментных препаратов и специального оборудования. формула изобретения/Способ получения рибонуклеозид-трифосфатов путем ферментативногосинтеза на основе субстрата в буфеое трио-НСЕ , Фермента экстрактаБзсЬемсЬ 1 а соБ В в присутствиимакроэргических фосфатных соединений и ионов Мо г при 37,0-37,2 С,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что,с целью упрощения процесса и повышения выхода целевого продукта, в качестве,субстрата используют рибонуклеиновую кислоту, в качестве Фермента - нефракционированный экстрактБзсфеисп 1 о сой ( В, в качестве макроэргическогоФосфатного соединения -ацетилфосфат, процесс проводят вприсутствии фосфата натрия прирН 7,8-8,2 в течение 4-5 ч.Источники информации,принятые во внимание при экспертизеЛ, Е.б СсюеИаМз, М,Е.боЫезюпап,н,о.каереп фА Медной 1 ое Ме ЙоЮез 1 з оУ к 1 ЬопцсЮеозЛйе апб 2 еохиооьос 8 еоз 1 ае-тг )опозрЪа 1 е фВ 1 осй,Вори. Ас 1 а ч.39, Я 1, р 82,Л 96 б