Способ получения дезоксирибонуклеиновой кислоты

Союз Соеетскик Социал истицескии Республик(51) М, Кл. С 12 Р 13 со еннем заявкиГосударственный комитет Совета Министров СССР по делам изооретеиий и открытий) Дата опубликования описания 03.07,7 72) Авторы изобретения Г. ф. Леванова и Евсиков Горьковский н 1) Заявите но-исснедоватепьский институт эпидемиопоги микробиопогии(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕИНОВОКИСЛОТЫ ипбямоИзобретение относится к области медицинской химии, а именно молекулярной биопогии микроорганизмов.Известен способ получения дезоксири бонуклеиновой кислоты путем вырашиван роорганизмов на питательной среде с поспедуюшим смывом и суспензированием биомассы в трис-( гидроксипметил)-аминометановом буфере, детинтеграцией биомас- сы в замороженном состоянии, повторным 10 суспендированием в буфере, депротеиниэацией свежеперегнанным фенопом, выдепением и очисткой целевого продукта 1.11 елью изобретения является попучения дезоксирибонуклеиновой кислоты из дифтерийных коринебактерий,Эта цель достигатеся тем, что смыв и суспендирование биомассы ведут при температуре роста микроорганизмов в присутствии трипсина, суспензию биомассы перед дезинтеграцией выдерживают в течение 2 ч при 36-37 С, а депротеионизацию ведут 50-70%-ным раствором тенопа, Повторное суспендирование биомассы ведут при соотношении биомассы и буфера 1:4.П р и м е р, Дифтерийные коринебактерии (как токсигенные, так и нетокси генные) наращивают в матрицах на 2, ном мартеновском агаре с 1%-ной нормальной пошадиной сывороткой в теромостате на 37 С. Смыв кпеток произвоо дят с неохпажденных матрацев ( л 37, С теппым ( 37 С) 0,1 М (оксиметип ипи гидрооксиметип) аминометановым трис-буфером, РН 7-8 с добавлением тр сина до конечной концентрации 500 мкг/мл, т.е. культура во время смыва находится при температуре ее выращивания. Полученную суспензию тепповых клеток предваритепьно выдерживают в термостате при 37 С в течение 2 ч,а затем центриофугируют 20 мин при 5000, об/мин (при механическом способе разрушения бактерий выдерживание в течение 2 ч не озатепьно)Дальнейшая обработка бактеет идти двумя путями;619509 40 45 50 55 филиал ППП фПатентф, г, Ужгород, ул. Проектная, 4 31. Биомассу свежих клеток носл замораживания при (-40 С) подвергаютоднократному .продавпиванию через щель20-25 мкм пи температуре пресс-формыравной (-40) С под давлением 20 атм.Разрушенную массу суспензируют в растворе, содержащем 0,15, (мопь) хлористого натрия и 0,1 (моль) динатриевойсолй этилендиаминтетрауксусной кислоты(ЭК 7 А) рН 8,0-8,5 ипи в указанном выше буфере, в отношении 1:4 (к 1 г спрес 10сованных кп добавляет 4 мл раствора). После встряхивания в течение 30 минсуспензии с равным 50-70%-ным объемомсвежеперегнанного спабошепочного фенола в бане со льдом (к 60 мл расплав 15пенного фенола добавляют 40 мл указанного раствора и доводят до рН 8,0-8,5,50%-ным раствором едкого натра), производят центрифугирование в течение40 мин при 5500 об/мин иа холоде.гоВерхний спой, содержащий извлеченныенукпеиновые кислоты, подвергают, крометого, еще одной хлороформенной делротеиниэации, т, е. заливают равным объемомсмеси хлороформ - изоамиповый спирт25(24:1) и взбалтывают в течение 20 мин,Разделение слоев осуществляют с помощью центрифугирования в течение 30 минпри 5000 об/мин. Из вновь образовавшегося верхнего слоя нукпеиновые кислотыосаждаются двойным объемом этиловогоспирта. Медузообраэный осадок после промывания в 70%-ном этанопе растворяютв стандартном сопевом растворе ССР(0,15 М ИаС 1 + 0,015 М цитрат натрия)и обрабатывают предварительно прогреОтой в течение 10 мин при 80 С рибойукпеаэой (РНК в .азой) фирмы "Яеаоа 8 фв конечной концентрации 200 мкм/мл втечение 1 - 1, 5 ч при 37 С, Затемпроводят обработку провазой (фирмы,Мегер") в концентрации 100 мкг/млв течение 1-1,5 ч при 37 С. Послеохлаждения смеси дальнейшую очисткуЙНК осуществпяют путем многократнойхн обработки до исчезновения среднего белкового слоя между водной и хпороформенной фазами (не менее3 раэ),Верхний водный слой, образовавшийсяв результате конечного центрифугирования,запивают двойным объемом этанола. Оформившийся осадок ДНК промывают в 70%атанопе, растворяют в 0,1 М ССР ипосле добавления раствора ЗМ ацетатанатрия с 0,001 М ЭДТА (рН 7,0) проводят дополнительное осаждение изопропаЦНИИПИ Заказ 4379/22 иолом для более тщательной очистки отбелков и полисахаридов,Описанный способ позволяет получатьсвыше 1 мг ДНК из 1 г спрессованныхклеток дифтерийных коринебактерий.Клетки, собранные по предлагаемомуспособу, заливаются атайопом на суткии более, а затем ДНК из них выделяется по методике А идг 4 с 1 аб(1968)за тем исключением, что вместо проназыпри пизисе клеток используют трипсинвдвое большей концентрации (т.е.200 мкг/мл), а додеципсульфат натрияв четыре раза (т. е. 1%). Кроме того,фенольная обработка должна повторяться не менее трех раэ; каждый разсдобавпением новой порции раствора, содержащего 0,15 М ХаС 1 + 0,1 М ЭДТА(рН 0,8-8,5) в количестве, равном отобранному верхнему слою, образующемуся поопе центрифугирования;Предлагаемый способ позволяет получать ДНК из дифтерийных коринебактерий, из которых с помощью общепринятых методик ДНК не выделялась, при атомобеспечиваетсясохранение дезоксирибонукпеиновой кислоты в коринебактериях от разложения собственными нуклеаэами и от химическойдеградации в процессе извлечения.формула изобретения1, Способ попучения дезоксирибонуклеиновой кислоты путем выращиваниямикроорганизмов на питательной средес последующим смывом и суспендированием биомассы в трио- (гидроксилметип)аминометановом буфере, дезинтеграциейбиомассы в замороженном состоянии,повторным суспендированием в буфере,де протеин изацией свежепе регранным фенолом, выделением и очисткой целевогопродукта, о т и и ч а ю щ и й с я тем,что, с цепью получения дезоксирибонуклеиновой кислоты из дифтерийных коринебактерий, смыв и суспендирование биомассы ведут при температуре роста микроорганизмов в присутствии трипсина,суспензию биомассы перед дезинтеграцией выдерживают в течение 2 ч при36-37 С, а депротеинизацию ведут 507 07 О-ным раствором фенола.2.Способпоп. 1, отличающ и й с я тем, что повторное суспендирование биомассы ведут при соотношениибиомассы и буфера 1;4,Источники информации, принятые вовнимание при экспертизе: