Способ получения холестериноксидазы

СОЮЗ СОВЕТСНИХсами ав юикРЕСПУБЛИН 801 026656 Э(59 Н 9 08 й ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ "(РГ) ф97 ПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ХОЛЕСТЕпредусматривающий кульпродуцирующего микроортом числе и рода 8 йгер 1 она питательной среде, дрожжевой экстракт, мйнеи КНРОМЯ 8047 НО и воду, с последующим Фермента из культуральной или из клеток, о т л ис я тем, что, с целью(54)(57)РИНОКСИДАЗЬтивированиганизма, вщусе 1 асеаесодержащейральные соРе 8047 НОвыделениемжидкости ич ающи ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИ(7) Берингер Маннхайм ГмбХ(прототип). удеюевления процесса, в качестве продуцирующего микроорганизма из рода 8 ВверФощусеВасеае используют 8 Сгерйоаусев дг 1 веойцвсцв 08 М 40191 или 8 Вгер 1 оеусев Мдговсор 1 сцв 08 М 40771 или 81 гертощусев ас 1 дощусей 1- сцв 08 М .40798 и/или АгЮгоЬасВег рагаййЫецв в 8 И 312.2. Способ по . 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что культивирование ведут на среде, в состав которой дополнительно вводят растворимый крахмал, ептон и минеральные соли СаСО, КЫОЭ,БаС 3. при следующем соотношении компонентов, вес.В:Растворимыйкрахмал 10" 30 Пелтон 2-10 ,Црожжевой экстракт 2-10 СаСО 1" 3 кто, О, 5-3Кг цРО О, 2-2Мдзо 47 но 0 5-3 ЯаСХ О, 2-2 Ре 80 70 О 001-005 в да Остальное1026656 Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается способа получения холестериноксидазы иэ микроорганизмов.Известны различные виды микроорганизмов - продуцентов холестерин-оксидаэы и способы получения этогофермента.Наиболее близким по техническойсущности и достигаемому результатук предлагаемому является способ получения холестериноксидаэы, предусмат"ривающий культивирование продуцирующего микроорганизма, в том числе ирода 81 гергощусе 1 асеае, на питательной среде, содержащей дрожжевой 15экстракт, минеральные соли КНРО,Мд 804 7 НО, Ре 804 7 НО и воду, с последующимвыделением Фермента иэкультуральной жидкости и/или изНедостаток такого способа состоитв необходимости добавления индукторов для повышения активности Фермента, которая невелика и достигает небольшой величины порядка 25100 О /лПель изобретения - удешевлениепроцесса.Поставленная цель достигаетсятем, что согласно способу получения холестериноксидазы, предусматривающему культивирование продуцирующего микроорганизма, в том числе и рода 81 гер 1 ошусе 1 асеае, напитательной среде, содержащей дрожжевой экстракт, минеральные солиК 1 НРО 4, МдЯО 4 7 НО, Ре 804 7 Н 20 иводу, с последующим выделениемФермента из культуральной жидкостии/или из клеток, в качестве продуцирующего микроорганизма из рода4081 герСовусе 1 асеае используют ЯВгергощусев дг 1 веогцвсив РЯМ 40191 илиЯгеровусев Мдговсорхсцв РЯИ 40771или 81 гер 1 ощусев ас 1 довусеМсцвРЯМ 40798 и/или АгЖгоЬасег рагайК 1-45иегов РЯМ 312,Кроме того, культивирование ведут на среде, в состав которой дополнительно вводят растворимыйкрахмал, пептон и минеральные солиСаСО, КБОЭ ,МаС 1 при следующемсоотйошении компонентов, вес,Ъг 50 81 герСоюусев п 1 дговсор 1 сцвВАС 2093, РЯМ 40771,ЛАСС 10976Общая характеристика: грамположительный, аэробный организм, который образует воздушный мицелий,Окраска: колонии воздушного мицелия при росте на дрожжево-солодовом агаре, агаре из овсяных хлопьев и крахмальном агаое с минеральными солями могут быть серии красных и серых тонов (корице-коричнево-се. рый), На задней стороне колоний не 55 60 65 Растворимыйкрахмал 10-30Пептон 2-10Дрожжевой экстракт 2-10СаСО 3 1-3кюэ 0, 5-3К НРО 4 О, 2-2Мд 804 7 Н О О, 5-3НаС 1 0,2-2Ге 804. 7 НО 0,01-0,05Вода ОстальноеСущность изобретения состоит виспользовании штаммов продуцентов холестериноксидазы, способных продуцировать Фермент беэ индукторана сбалансированной по ростовым Факторам питательной среде подобранного состава.Ниже представлены характеристикииспользуемых согласно изобретениюштаммов микроорганизмов.81 гер 1 оюусев дг 1 веойцвсцв1616, РЯМ 40191,АТСС 23916Общая характеристика; грамположительный, азробный организм, которыйобразует воздушный мицелий.Окраска; колонии воздушного мицелия при росте на дрожжево-солодовомагаре, агаре иэ овсяных хлопьев, накрахмальном агаре с минеральнымисолями и на глицерин-аспарагиновомагаре могут быть серии красных илисерых тонов (корице-коричнево-серый,)На задней стороне колоний не видноникаких специфических пигментов.Растворимые пигменты: никакогообразования меланоидных пигментовв пептон-дрожжевом агаре с железом,тироэиновом агаре или триптон-дрожжевом питательном растворе, а такжеобразования пигментов в дрожжевосолодовом агаре, агаре из овсяныххлопьев, крахмальном агаре с минеральными солями или глицерин-аспарагиновом агаре нет.Морфология цепи спор: спиральныеучастки. Зрелые, узкоспиральныецепи спор содержат 10-50 спор, поверхность спор гладкая.Использование С-источниковИспользование Р-глюкозы, Ь-арабинозы, Р-ксилозы, Р-маннита и Р-Фруктозы. Никакого роста или скудныйрост на сахарове, инозите, рамнозе,рафинозе и лактозе.Образцы алифатических жирныхкислот: для представителей семейства 81 гер 1 овусеСасеае характернопреимущественное наличие изо/антеизо-Си изо/антеизо-С,. Стенка клетки содержит типичную для Яггерошусев ЬЬ-диамииопимелиновую кислоту, РЬ-Диаминопимелиновая или окси-РЬ-диаминопимелиновая кислота отсутстяудт.. Использование 0-глюкозы., Ь-арабинозы, 0-фруктозы и сахаровы. Нивидно никаких специфических пигментов.Растворимые пигменты: никакогообразования меланоидных пигментов впептон-дрожжевом агаре, а также образования йигмента в дрожжево-солодовом агаре, крахмальном агаре сминеральными солями и агаре из овсяных хловьев нет.Морфология цепей спор; спиральныеучастки. цепи спор в узких, х эамкнутых спиралях, часто на ножках,состоят иэ 10-50 спор, поверхностьспор гладкая.Использование С-источников.Использование 0-глюкозы, 0-ксилоэы, 0-фруктозы и 0-маннита. Никакого роста или очень скудный рост наЬ-арабинозе, рамноэе, сахарове, рафинозе, инозите и лактозе.Образцы алифатических кислот:20для представителей семейства 81 гер 1 овусейасеае характерно преимущественное наличие иэо/антеизо-Сиизо/антеизо-С-алифатических кислот.Стенка клетки содержит типичнуюдля Яггер 1 опусея ЬЬ-диаминопимелиновую кислоту. 0 Ь-Диаминопимелиноваяили оксиЬ-диаминопимелиновая кислота отсутствует.81 гер 1 овусея асЫопусеМ 1 сия 30ВМТП 1873, 08 М 40798,АТСС 11611Общая характеристика: грамположительный, аэробный организм, который образует воздушный мицелий. 35Окраска: колонии воздушного мицелия при росте на дрожжево-солодовомагаре, агаре иэ овсяных хлопьев икрахмальном агаре с минеральнымисолями могут быть серии красных (серых) тонов (розовый, корице-коричневый). На задней стороне колонийпри росте на дрожжево-солодовом агаре заметен пигмент желто-коричневого цвета, на агаре из овсяных хлопьев - красно-коричневого цвета и йакрахмальном агаре с минеральнымисолями - черного цвета.Растворимые пигменты: образование меланоидных пигментов в пептондрожжевом агаре с железом. Другиепигменты типа упомянутых не образуются,Морфология цепей спор: участкиНег 1 паси 11 арег 11 со многими прямогибкими цепями спор при росте надрожжево-солодовом агаре. На агареиз овсяных хлопьев и крахмальномагаре с минеральными солями - образование крючков, петель и короткихнерегулярных спиралей. Поверхность 60спор гладкая.Использование С-источников. какого роста на рамнозе, лактоэе, рафинозе, Ь-манните и иноэите.Для представителей семейства 8 Ыер 1 ощусегасеае характерны изо/антеиэо-Си изо/антеиэо-С-образцы алифатических кислот.Стенка клетки содержит типичную для 81 герговусев ЬЬ-диаминопимелиновую кислоту. 0 Ь-Диаминопимелиновая кислота илиоксиЬ-диаминопимелиновая кислота отсутствуют.АгЖпгоЬас 1 ег рагайГ 1 пецвВМТБ 501, 08 М 312.Морфология: от коротких до средней длины, коринеобразные столбики с типичным "снаппинг" -делением. Нет никакого явно выраженного цикла развития, клетки на всех фазах развития столбикообразные. Клетки грамположительны и неподвижны. Никакого образования спор. Колонии на Н 0-агаре бело-кремовой окраски и блестящие; нет никакого образования пигментов;Физиологические свойства.Отношение к кислороду - ярко выраженное аэробное; образования кислот из глюкозы и лактозы не происходит каталиэата образуется; оксидаэа не определяется восстановление нитрата - положительное; расщепление крахмала, желатины и каэеинаотрицательное; расщепление трибутурина - слабо положительное; уреаза образуется образование индола и К 8 - отрицательное; использование цйтрата - положительное; солевая толерантность - расчет в случае 5% НаС 1, никакого роста при 10 ИаС 1.Пептйдогликан стенки клетки содержит меэо-диамино-пимелиновую кислоту.П р и м е р 1, 81 гер 1 ощусея дгьяевйцясця 08 М 40191 ( равноценен ОТСС 23916 и 1 ГО 12870) культивируют в среде следующего состава, г/л.Растворимыйкрахмал 20Дрожжевой экстракт(Дифко)4Пелтон (мясной)5Карбонат кальция 3Нитрат калия 1Дикалий" Аосфат К 2 НРО 4 О, 5мдзо 4.7 НО 1,03Хлористый натрийГе 8 О 4 7 НО 0,02 Итамм культивируют 2 дня в 10 мл среди в колбе Эрленмейера на 100 мл, затем переносят в 40 мл такой же среди в колбе Эрленмейера 3 дня), отбирают пробу и проверяют активность холестерином дозы в отделенном культуральном растворе и в экстракте-сырце. Экстракт-.сырец получают центрифугированием 5 мл культуЭкст- трактсырец, о/л Культуральнь 1 й раствор .после отделенияО/л Длительностькультивирования,дни Пример 4765 1260 3506 5223 1423 3800 1656 721 935 3 711 2052 Составитель И. ПриваловаРедактор Н. Безродная ТехредО. Неце Корректор В, Бутяга Тираж 523 Подписное ВНИИПИ Государственного кочнтета СССРЗаказ 4591/51 Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул, Проектная, 4рального раствора, промыванием биомассы 0,05 М ФосФатным буФером рН 7, торным суспендированием в 5 мл такого же буФера и распределением посредством добавки 0,2 мл 10-ного раствора продукта "Тритон-К". После 10 мин выдержки при комнатной температуре центриФугируют и получают отделившийся культуральный раствор в виде экстракта- сырца.Лля проведения определения активности измеряют образование холестенона посредством прироста погасания экстринкции) при 240 мм, при рН 7,5 в 0,5 моль/л ФосФатном буФере, Для контроля каждый раз определяют холостую величину без добавления холестена.Были получены следующие значения м /лгОбщее - культурального раствора 5741Экстракта-сырца,полученного изэтого раствора 1118Отделенного культурального раствора4623П р и м е р 2. Повторяют способ по примеру 1 с применением ВСгеровуСев Мдгозсор 1 сиз РЯМ 4077 (соответствует АТСС 10976).Определения проводят через 3 и 4 дня в течение культивирования.Значения активности приведены в таблице.В случае культивирования в присутствии 2 холестерина в качестве индуктора прирост активности составляет величину меньше половины,П р и м е р 3. Повторяют способ по примеру 1 с применением 81 гер 1 о вусез асЫовусеФ.1 сцз РЯМ 40789 соответствует АТСС 11611 и 1 РО 3125,Результаты при длительности культивирования 3 и 4 дня показаны в таблице. 30 При проведении культивированияпри наличии 2 холестерина в качест:ве индуктора прирост активностиувеличивается на 50,П р и м е р 4. Повторяют способ15 по примеру 1 с применением АгййгоЬасСеп рагаКЙ 1 пеоз РЯ 312 (соответствует АТСС 15591), однако при условии добавления к среде 3 холестерина в виде суспензии в дрожжевомэкстракте суммарное количество10 г/л). После четырехдневного культивирования в экстракте-сырце обнаружено значение М/л= 4470. В культуральном растворе после отделениятакже установлена значительная активность.Применение: изобретения позволяет "существенно удешевить способ произш.водства .за счет достижения болеевысоких значений активности холестериноксидазы. При этом особое преимущество заключается в возможностиисключения индуктора холестериноксидазы, что приводит не только к дополнительному удешевлению способа,35 но также к значительному повышениювоспроизводимости способа.