Способ получения лейцил-глицил-глицин-аминопептидазы

57833 С А РЕТ Сооэ СоветскихокиалистическихРеснублик Ни ВТОР СКОМУ ЕеЕДЬС(61) Дополнительное к (22) Заявлено 23,02.76 ву 6,28-1 21) исоединением заявки Ъо Государственный комите) Приоритет Совета Министров СССРпо делам изобретений дстень М 40 53) УДК 577.15.6(71) Заявител нститут биохимии им. А. В, Палладин Й ЦИЛ-ГЛ И ЦИЛ-ГЛ И ЦИ НИДАЗЫ Сущность предлагаемого способа заключается в обработке ферментного сырья из штамма Лзрсгр 1 пз, осаждении белков сульфатом аммония, обессоливанпп белкового осадка, фракционпрованпп белков колоночной хроматографией на сефадексе, диализе пептидазной фракции с выделением целевого продукта и его лиофилизации в фосфатном буфере, Концентрированный препарат поверностной культуры Азрегрцз 1 ацз растворяют в воде с добавлением 0,001 в ,0001 М раствора лор истого кобальта, осаждают нпзкомолекулярные белковые примеси этанолом. В полученной после дробного осаждения и центрифугирования ферментной фракции инактивируют протеиназу нагревом в течение 10 - 15 мин, обеспечивая перепад температур от 62 до 20 С, а очищенную лейцил-глицпл-глицин-аминопептидазу лиофилизуют из кобальт- содержащего раствора при рН 7,8 - 8,0,П р и и е р. 100 г концентрированного препарата поверхностной культуры Лзрегр 1 1 цз 1 а цз - флавизина, полученного Украинским научно-исследовательским институтом пищевой промьшленности, обрабатывают семикратным объемом воды, содержащей ионы Со", в течение 2 час для извлечения низкомолекулярнывеществ и другпримесей. Смесь центрифугируют в течение 40 мин при 3000 об/мин. Полученный раствор, содержа(43) Опубликовано 30,10. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛЕАМИ НОП ЕП Изобретение относится к области технической микробиологии и может быть использовано для получения ферментных препаратов, в частности пептидаз из микробиологического сырья.Известен способ получения лейцил-глицилглицин-аминопептидазы, предусматривающий осаждение белков из ферментного сырья, полученного из грибов рода Лзрегрцз, обессоливание белковой фракции, фракционирование белков колоночной хроматографией на сефадексе, диализ пептидазной фракции с выделением целевого продукта и его лиофилизацию в фосфатном буфере.Однако используемые в известном способе в качестве ферментного сырья штаммы Азрегр 11 цв огукае и азрегр 11 цз рагакШсцз продуцируют токсины, от которых не удается освободиться на последующих этапах очистки.Цель изобретения - получение фермента, свободного от токсичных примесей, и повышение его стабильности.Для этого осаждение белков из ферментного сырья, полученного из грибов рода Ларе- р 11 цз, проводят в присутствии ионов кобальта, перед диализом осуществляют инактивацию протеиназы, а лиофилизацию проводят при рН 7,8 - 8,0. При этом протеиназу инактивируют нагревом в течение 10 - 15 мин до 62 С с последующим охлаждением до 20 С.578335 10 Ф ор мула изобретения 30 Составитель Т, Серебренникова Текред Л. Гладкова Корректоры; Е. Хмелева и А. СтепановаРедактор М. Дмитриева Заказ 2455/2 И д Ио 893 Тираж 563 Подписное НПО Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Типография, пр. Сапунова, 2 гций пигменты, примеси углеводородов, протеазы и пептидазы, охлаждают до 2 С и прибавляют этиловый спирт до конечной концентрации 50/, при температуре - 8 С. Выдерживают систему в течение 20 мин, а затем центрифугируют на холоде.Полученный белковый осадок, содержащий протеазы и пептидазы с примесью углеводов и пигмента, растворяют в двойном количестве по отношению к исходной навеске флавизина дистиллированной воды, содержащей ионы Со-. Нерастворившуюся часть удаляют центрифугированием.К надосадочной жидкости, содержащей протеазы и пептидазы, прибавляют сухой сульфат аммония до 40% от полного насыщения и выдерживают в течение 15 - 18 час при комнатной температуре. Белок, выпавший в осадок, отделяют центрифугированием, а в полученном растворе проводят повторное насыщение сульфатом аммония до 80 с/, от полного насыщения. Через 6 - 8 час смесь центрифугируют, а осадок, содержащий протеины и пептидазы, растворяют в половинном обьеме дистиллированной воды, содержащей ионы Со+. От сульфата аммония освобождаются диализом против 0,0067 М фосфатного буфера при рН 7,8 - 8,0.Для ин активации протекпазы полученный диализат подогревают до 62 С в течение 10 мин и сразу же охлаждают на водяной бане до 20 С, Денатурированный белок, содержащий пептидазы, удаляют центрифугированием, а пептидазную фракцию очищают на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой при линейном градиенте 0,1 - 0,7 М ХаС 1 в 0,02 М фосфатпом буфере при рН 7,8 - 8,0,Активную фракцию, полученную после обессоливапия диализом, хроматографируют на сефадексе Гв фосфатном буфере и лиофилизуют из кобальтсодержащего раствора при рН 7,8 - 8,0.Расчет активности ЛГГ-аминопептидазы проводят по формуле:Активность лейцил-глицил-глицин-аминопептидазы =а 1000 10 з 100 оедбс 1 хУО где а - количество очищенной аминокислоты(в перерасчете по оптической плотности), у; 1000 - перевод у в мг;10 з - перерасчет до целого числа;6 - молекулярный вес расщепленного пептида;с - навеска фермента, у;/ - время инкубации, мин;100-- перерасчет на 1 мг чистого белка;хо,х% - содержание чистого белка в препарате,Способ позволяет получить высокоочищенпый препарат лейцил-глицил-глицин-аминопептидазы, гомогенный при электрофорезе в 15 полигкриламидном геле, а также при исследовании его методом экзимэлектрофореза.Предлагаемый способ позволяет получитьпрепарат ЛГГ-аминопептидазы с активносгью, составляющей 24% по сравнению с 20 активностью концентрированной поверхностной культуры Азрегр 11 цз Иацз, со степенью очистки в 237 раз и свободный от токсических примесей.Полученный лиофилизированный фермент 2 о ный пРепаРат полностью сохРанЯет исхоДнУюактивность в течение года при хранении его при 4 С. 1. Способ получения лейцил-глицил-глицин-аминопептидазы, предусматривающий осаждение белков из ферментного сырья, полученного из грибов рода Азрегр 11 цз, обессоливание белковой фракции, фракционирование белков колоночной хроматографией на сефадексе, диализ пептидазной фракции с выделением целевого продукта и его лиофилизацию в фосфатном буфере, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью получения фермента, свободного от токсичных примесей, и повышения стабильности фермента, осаждение белков из ферментного сырья, полученного из грибов рода Азрегр 11 цз, проводят в присутствии ионов кобальта, перед диализом осуществляют инактивацию протеиназы, а лиофилизацию проводят при рН 7,8 - 8,0.2. Способ по п. 1, отличающийся тем,что протеиназу инактивируют нагревом в те чение 10 - 15 мин до 62 С с последующим охлаждением до 20 С.