Способ выделения ферредоксина

(9) 5 12 Ю 9 НИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ия и фотоин В, К. Выде.тьев тепло1 з ваг 1 чцввып. 5,К. С. воагег 1 ваг 1 оп о в, - Р 1 ацг447-449. ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ АВТОРСНОМУСВИДЕТЕЛЬСТ(71) Институт почвоведесинтеза АН СССР(56) Мухин Е. Н., Гннсние ферредоксина из лислюбивого растения СцсцшБиохимия, 1972, т. 37,с. 1012-108.Сгаюйогй С., 2 ецвеп, с 1 оп апй Рагг 1 а 1 СЬагасРеггейох 1 п Егош 2 еа шауРЬув 1 оояу. 971, 47, Р(54) (57) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ФЕРРЕДОКСИНА из высших растений, включакнцийгомогенизацию сырья и стадии очистки: фракционирование сульфатом аммония, гельфильтрацию на сефадексеи ионнообменную хроматографию наДЭЫ-целлюлозе, о т л и ч а ю -щ и й с я тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта и сокращения времени его выделения извысших растений, используют листья4-5 - недельных растений семействазлаковых, бобовых или тыквенных,.а гомогенизацию сырья проводят вбуфере при массовом соотношениилистья:буфер 1:5 с добавлением 0,35- Е0,50 М НаС и 0,01 - 0,02 М меркаптоэтанола.гИзобретение относится к биохимии, а именно к способу получениявысокоочищенных ферментных препаратов, и может быть использовано в про"изводстве ферментных препаратов, атакже в научных исследованиях побиохимии и Физиологии растений, молекулярной биологииЦелью изобретения является повышение Фотовосстановительной активности, увеличение выхода целевогопродукта и сокращение времени его вы"деления.Цель заключается в том, что сог"ласно способу выделения ферредоксинаиз высших растений, включающему гомогенизацию сырья и стадии очистки:фракционирование сульфатом аммония,гельфильтрацию на сефадексе и ионнообменную хроматографию на ДЭАЗ-целлюлозе, используют листья 4-5-.недельных растений, гомогенизацию сырьяпроводят в буфере в соотношении 1:5с добавлением 0,35 - 0,50 М ИаС и0,01 " 0,02 М меркаптоэтанола.П р и м е р 1, Свежие листья 45-недельных растений гомогенизируютв буфере в соотношении 1:5 с добавлением 0,35"0,50 М БаС и 0,010,02 М меркаптоэтанола. Гомогенатотжимают и проводят фракционное высаливание с последующим центрифугированием, Первый осадок отбрасывают.Второй осадок используют для получения ферредоксина, который растворяют в трис-НС 1 буфере и обессоливают на сефадексе 6-50. Дальнейшуюочистку Ферредоксина проводят с использованием двухкратной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе.П р и м е р 2, Растения пшеницысорта Московская 35 выращивают воткрытом грунте, Навеску свежихлистьев (четырехнедельные растения)100 г гомогенизируют в 500 г буферной смеси следующего состава, М:трис-НС 1 0,05 (рН,8,2); 0,35 ИаС 1;0,0 МЭ (т,е. в соотношении 1:5), вгомогениэаторе в течение 2 мин, Полученную темно-зеленую массу фильтруют через полотно,ФракЦионное осаждение балластных:белков проводят из гомогената листьев, добавляя соль из расчета 25 г сульфата аммония на 100 мл раствора. Послецентрифугирования при 6000 об/минв течение 10 мин осадок отбрасывают,а к супернатанту добавляют 36 г55640 2 30 или в замороженном состоянии при 5 1 О 15 20 35 40 45 50 55 сульфата аммония и через 1 О мин центрифугируют при указанном режиме втечение О мин. Осадок, содержащийферредоксин, растворяют в 40 мл0,05 М трис-НС буфере, 0,01 М МЭ,рН 9 и центрифугируют при 6 тыс.об/мин в течение 5 мин для удалениябалластных белков, Супернатант подвергают обессоливанию и очистке отвысоко- и низкомолекулярных веществпутем фильтрования через колонку(40 х 40 см) с сефадексом С,уравновешенную 0,05 М трис-НСрН 8,2, 0,01 М МЭ. Белок элюируюттем же буфером,Обессоленный белковый раствор сФерредокснновой активностью наносят на колонку размером (3 х 1,5 см)с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенной0,05 М трио-НС 1 буфером рН 8,20,3 М НаС 1, 0,0 М МЭ. Колонку последовательно промывают 0,05 М трисНС буфером рН 8,2 с добавкой 0,1 М,0,15 М БаС 1, ферредоксин злюируют 0,1 М трис-НС 1 буфером с добавкой 0,17 М ИаС 1, Ионнообменную хроматографию проводят повторно на колонке (1 х 1 см) с ДЭАЭ-целлюлозой, ферреодоксин хранят при О С под азотом 20 С в течение длительного времени без потери активности.В табл. 1 приведены результаты получения 5 елка из 100 г листьев пшеницы сорта Московская 35,Гомогенность выделяемых белков доказана седиментационным равновесием на аналитической ультрацентрифуге, модель Е, при электрофореэе в 103-ном полиакриламидном геле.Активность ферредоксина определяют по скорости Фотовосстановления НАДФ хлоропластами пшеницы в реакционной смеси следующего состава: мкмоль МяС 10; НАДф Оуб М Ферреоксина; 0,05 М трис-НСС буфера (рН 8,2), 10-хлорофилла.П р и м е р 3. Выделение ферредоксина из листьев пшеницы ведут аналогично примеру 1, но с использованием механического измельчения замороженных листьев в соотношении листья:буфер 1:2 и без добавок, снижают выход белка в 1,5 - 2 раза и активность в 1,5 раза.П р и м е р 4. Выделение ферредоксина из листьев люцерны, выращенной в открытом грунте, ведут анало1255640 Таблица 1 7 от исОбщий белок, мг Активностьферредоксина,мкмоль НАДФН Стадии очистки ивыделения фермента ходногобелка мг хф ч Гомогенат излистьев 2500 100 1540 61,6 Второй осадок Сефадекс С780 31,2 ДЭАЭ-целлюлоза 11 О 4,4 80 0,08 200 ДЭАЭ-целлюлоза гично примеру 1, Выход ферредоксина 3,5 - 4 мг на 100 г листьев с фото- восстановительной активностьюмкмоль НАДФНмг хф чП р и м е р 5. Выделение ферредоксина из листьев гороха, выращенного в открытом грунте, ведут аналогично примеру 1. Выход ферредоксина 3-3,5 мг на 100 г листьев с фотовосстановительной активностью 120 мкмоль НАДФНмг хф чП р и м е р 6, Выделение ферредоксина из листьев огурцов, выращенных в открытом грунте, ведут аналогично примеру 1. Выход ферредоксина 3,0-3,5 мг на 100 г листьев с фото- восстановительной активностьюмкмоль НАДФНмг хф ч В табл. 2 дана активность предлагаемого ферредоксина и выход белка из 100 г листьев пшеницы сортаМосковская 35, люцерны, огурцов, гороха в сравнении с известным,П р и м е р 7. Граничные и оптимальные значения МаС 1 0,35-0,5 М имеркаптоэтанол 0,01-0,02 М,Результаты опытов даны в табл, 3.П р и м е р 8. Запредельные значения параметров. При изменении каждого из параметров все остальные оптимальны (как впримере 1).Результаты даны в табл. 4,5 П р и м е р 9, Влияние соотношения зеленый материал:буфер на выход выделенного белка показано втабл. 5.П р и м е р 10, Выход ферредоксина в зависимости от возраста растений дан в табл. 6.П р и м е р 11. Сокращение времени получения предлагаемого ферредоксина за счет исключения и сокращения ряда операций позволяет провести весь процесс за 4,5-5 ч, тогда как известного за 30-48 ч.Результаты опытов даны в табл. 7.Преимуществом предлагаемого способа по сравнению с известным является использование комбинации стадий очистки - гомогенизации сырья вбуфере при массовом соотношениилистья:буфер 1:5 с добавлением0,35 М - 0,5 М и 0,01 - 0,02 М меркаптоэтанола в сочетании с фракционным осаждением сульфатом аммония,что позволяет увеличить выход целевого продукта в 1,5 - 2 раза с полу 11 чением более высокоактивного ферредоксина с высокой степенью чистотыи сократить время его получения до4,5 - 5 ч.1255640 Таблица 2 Активность ферредоксина в реакции фотовосстановления НАДФ хлоропластами, мк моль НАДФНсогласно мг хф чспособу Листья выс растенийизвестному предла- гаемому предла- гаемому известному Люцерна 220 110 Зф 5 4 вО 2)0 2 э 5 Пшеница сорта Московская 35 3,5-4,1 220 1,8-2,0 120 180 Таблица Характеристики Концентрация, М 0,35 0,42 0,50 0,01 0,015 002 ЯаС 1 Меркаптоэтанол Выход,мг100 г листьев пшеницы мкмоль НАДФНАктивность,ф мг хф ч 200 200 180 Таблица 4 Активность,Выход, 00 г сырь 1 х%истьев - - ----мк моль НАДФН мг хф чРе агент Концентрация, М ЯаС 1 0,3 3,1 200 190 0,55 3,0 Иеркаптоэтанол 0,05 3,5 150 0,25 3,9 160 ГорохОгурцы Выход целевогопродукта из100 г листьев,мг, согласноспособу ЗфО Зв 5 1 э 5 2 ьО ЗэО-Зв 5 1 ф 5"1 э 81255640 Т а блица 5 Выход белка Соотношениелистья:буфер 1:6 Очень сильное разбавление белков,экстрагируемых из листьев, чтовлечет за собой потерю до 103белка. Трудно работать на центрифуге сбольшими объемами раствора белков. 1:2 ферредоксин извлекается из листьевне полностью 1:3-15 Эти значения оптимальны для 100%выхода ферредоксина Таблица 6 Растения Выход ферредоксинамгпо способу известному предлагаемому Люцерна двухнедельные проростки 1,5-2 2,2-2,5 4-5-недельные растения 3,5-4 Горох двухнедельные проростки.л1,5-2 2,2-2,6 4-5"недельныерастения 3,0-3,5 Огурцы двухнедельные проростки 1,5-1,8 2,2-2,4 4-5-недельныерастения 3,0-3,5 Ф Эти определения авторы раньше не проводили (с растениями 4-5-недельного. возраста).Характеристики известного предлагаемого Иэмельчение матери 0-10 2-00 Экстракция (размораживание) 2-00 0-5 2-00 0-10 1-00 Второе размораживание 0-10 12-00 0-О 1-00 3-00 0-50 мелкий Ссредний 1-00 3-00 2-00 1 колонка 1-0.0 2-00 П колонка Сефадекс С2-00 30-00 5-00 Общее время Составитель В. СоинаТехред Л.Олейник Корректор И, Эрдейи Редактор Н. Гулько Заказ 4787/29 Тираж 490 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Первое высаливаниеЦентрифугирование центрифугирование Обессоливание на сефа- дексе Ионнообменная хроматография наДЭАЭ-целлюлозе 1255640 10 Таблица 7 г,Время основных операций, ч-мин, для способа