Способ получения днк-полимеразы из ядер печени крыс

СОЮЗ СОВЕТСНИХлллллллллРЕОЪБЛИН А БРЕТЕ л ОПИСАН АВТОРСКОМ ЬСТ УСВ лл(22) (46) (71) фиэи (72) 3 6 ЛоЬп рагг чег и реап ч. 3 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ 376744828-1406.07.8423.05.86, Бюл. В 19Ленинградский институт ядерной ки им. Б.П.Константинова Н.В.Белякова и В.М.Крутяков 615.45-547.965(088.8)Накипев М.Е., МИсгеЫзпщЬе К.С акоп ЛЯ. РцгН 1 сагюп апй ай сЬагасгегдзагоп ой гас И- цс 1 еаг ПАЛА. роИшегдзе. - ЕигоЮ. оГ ВдосЬеазггу, 1972, , У 1, р, 119-129. лЯО д,2 лллл 2 Щ50 4 А 61 К 37/18(54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНЧЯ ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ- Р ИЗ ЯДЕР ПЕЧЕНИ КРЫС с помощью хроматографии и центрифугирования, о т л и ч а ю щ и й с я тем,что, с целью упрощения и стабилизации получаемого препарата, ядра печени крыс обрабатываются 1 Х-нцмраствором тритона Х, экстрагируют0,.3 М раствором. хлористого натрия,очищают от примесей хроматографиейна ДЕАЕ сефадексе Аи осаждениемсульфатом аммония при 50 Х-ном насыщении, высаливают сульфатом аммонияпри 803-ном насыщении, подвергаютгель-Фильтрации на сефадексе 9-75и обрабатывают гидроксилапатитом.1 123Изобретение относится к медицине,в частности к биохимическим способамочистки белков.Цель изобретения - упрощение способа и стабилизация получаемого препарата за счет сокращения количестваэтапов и присутствии сопи высокойконцентрации,Способ осуществляется следующимобразом. 1Получают хроматин из печени крыс.Экстракт хроматина используется дляизвлечения целевого продукта, Очищают целевой продукт от примеси нуклеиновых кислот путем хроматографиина колонне с ДЕАЕ сефадексом А 25 в0,3 М БаС 1. Очищают от примесныхбелков фракционируют белки сульфатом аммония; .очищают целевой продуктот белков путем гель-Фильтрации насефадексе С; очищают целевой продукт от примесей нуклеаз с помощьюобработки элюата гидроксилапатитом,П р и м е р. Ткань печени крыслюбой породы, пола и возраста (60 г)измельчают ножницами и гомогенизируют.в стандартном лабораторном(отечественном) гомогенизаторе при8000 о в 560 мл среды, состава:0,25 М сахароза, 5 щМ трис-НС 1,рН 7,8;1 щМ ЭДТА и 3 щМ М,С 1 после чегоФильтруют через 8 слоев марли. Получают 600 мд гомогената. Гомогенат центрифугируют при 2000 о 15 мин.Супернатант отбрасывают. Осадок ядеродин раз промывают в 200 мл той жесреды. Отмывка состоит в следующем.Осадок ресуспендируют и гомогенизируют 10 раз в слабо притертом гомогенизаторе Даунса (стекло/стекло).Затем центрифугируют при 2000 о 5 мин.Промывную среду отбрасывают. Осадокресуспендируют тем же способом в50 мл среды для гомогениэации.К ресуспендированным в среде длягомогенизации ядрам прибавляют припостоянном перемешивании стекляннойпалочкой равный объем 1 Е-ного раствора тритона Хв той же среде иосторожно (чтобы не разрушались ядра)перемешивают в течение 1 мин. Затемцентрифугируют при 600010 мин исупернатант отбрасывают. 2261 2 20 тина пропускают через колонку, При 25 30 З 5 40 45 50 55 Осадок ресуспендируют в 100 мл среды состава; 17-ный тритон Х, 10 щМ трис-НС 1, рН 8,0; 2 щМ ЭДТА и гомогениэируют 15 раз в гомогенизаторе Даунса, после чего центрифугирунт при 6000 о 10 мин. Супернатант отбрасывают. Осадок представляет собой хроматин, который ресуспендируют и гомогенизируют 10 раз в гомогенизаторе Даунса в 100 мл буфера состава: 10 щМ трис-НС 1, рН 8,0.Хроматин в течение 30 мин экстрагируют в соотношении 1:5 по объему в среде состава: 0,3 М НС 1, 10 М трис-НС 1, рН 8,0 в гомогенизаторе Даунса, Затем центрифугируют при 6000 п 10 мин. Осадок отбрасывают. Супернатант используют для дальнейшей очистки целевого продукта из хроматина.Колонку объемом 50 мл с отношением диаметра к высоте 1:4 уравновешивают средой состава: 0,4 М МаС 1, 10 щМ трис-НС 1, рН 8,0, Экстрат хромаэтом отбрасывают элюирующий буфер,составляющий "свободный объем" колонки и равный 1/3 объема набивки, После этого собирают объем злюата, равный объему нанесенного препарата. Кпрепарату, полученному после хроматографии на сефадексе ДЕАЕ А, добавляют прн смешивании за 30 мин сульФат аммония до 50%-ного насыщения,Перемешивают 30 мин, после чего центрифугируют 10 мин при 6000 о и осадок отбрасывают. К супернатанту прибавляют сульфат аммония до концентрации 807 насыщения и оставляют до утра. Затем центрифугируют при 6000 и 30 мин, Осадок растворяют в 20 мл буфера состава: 1 М ИаС 1, 107-ный глицерин, 10 тпМ трис-НС 1, рН 8,0. Супернатант фильтруют на вакуумном отсосе через миллипоровый фильтр 1 11Сынпор. Осадок с фильтра объединяют с осадком после центрифугирования. Колонку объемом 1000 мл (отношение диаметра к высоте 1:300) уравновешивают буфером состава: 1 М ИаС 1, 107-ный глицерин, 10 щМ трис-НС 1, рН 8,0. Полученный осадок наносят на колонку и элюируют со скоростью 50-30 мл/ч. Отбрасывают первые 457 элюата (7 от общего объема колонки) и собирают последующие 157 элюата. Стадию выполняют беэ определения ферментативной активности, Элюат диализируют от ИаС 1 к буферу состава: 20 щМ КН, РО, 107-ный глицерин, рН 7,5.К отдиализованному элюату в стакане добавляют 10-15 мл гидроксилапа2322 10 Актив- Выход (обность, щая активед/мг ность), ед. Концентр. Всего белка, белка, мг/млмг Объем,фракция по ходувыделения Гомогенат печени 600 26 5600 0,0075 117 Экстрактхроматннав 0,3 М ИаС 1 90 90 1,1 Сульфат аммония 50-807.-ного на 50 0,375 20 сыщения Хроматография насефадексе 6-75 4 35,0 2 50,0 200 0,02 20 0,10 Гидроксилапатит 100 Составитель М,ПознякРедактор Е. Папп Техред И.Попович Корректор Л. Пилипенко Заказ 2722/6 Тираж 660 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва Ж, Раушская наб., д. 4/5Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 тита и в течение 30 мин перемешиваютЗатем центрифугируют при 6000 и 5 мин.Супернатант отбрасывают. Осадок ресуспендируют в 25 мл буфера состава:70 шМ КНРО, 0%-ный глицерин,рН 7,5;10 .мин перемешивают и центрифугируютпри 6000 и 5 мин. Супернатант отбрасывают, Осадок отмывают таким же образом, тем же буфером еще два раза.При этом -полимераза не смываетсяс гидроксилапатита. Осадок послетретьей отмывки ресуспендируют в20 мл буфера состава: 300 шМ КНРО,107-ный глицерин, рН 7,5; перемешивают 30 мин, центрифугируют при156000 о 5 мин. Супернатант представляет собой препарат-полимеразы.Фермент хранят в 507-ном глицерине, О, М НаС 1, 0,05 шМ трис-НС 1,рН 8,0 при 20 ОС. Препарат сохраняетсвою активность в течение 6 мес.Условия хранения значительно проще (темопература 2 О С, отсутствуют растворы,загрязняющие препарат),В таблице представлены реэультаты очистки целевого продукта на раз 61 4личных стадиях. Иэ сопоставления значений первой и последней стадий видно, что активность возрастает с0,0075 до 50,0 ед, на 1 мг-белка, Выход целевого продукта по общей ферментативной активности составляет807. За 1 единицу активности фермента принимают количество фермента, катализирующего включение в ДНК 1 нТ моль общего НТФ эа 1 ч при 37 С в оптимальных условиях инкубации. В известном способе достигается очистка целевого продукта в 800 раз по сравнению с ядрами из гомогената печени.Упрощение способа происходит за счет сокращения количества этапов (известный способ - 10, предлагаемый - 7), времени выделения конечного продукта в результате отсутствия длительных этапов диалиэа и многочасового высокоскоростного центрифугирования.