Питательная среда для культивирования бактерий providencia sтuаrтii продуцента рестриктазы рsт 1

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИА ЛИСТИЧЕСНИ ХРЕСПУБЛИК(5)4 С 12 М /20 9 ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИРИ ГКНТ СССР ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ методика производгочЫепсда яГцаггдд. НПО "Биолдр". Изобре нологии, а питательнь бактерий Р ие относится к биотех ктозу, новы р рода глюкозу и д в кзчесттельной не пи лиздт менно касдетсл с нбныи гид ро 11 пчнсн)и ком -днд при след ов, г/л: ный гидр сред длл культивироягцаггддяг 1,ннлнетсн ддепс 1 а иктлзы ретенин онент Рыбоч лро 45,0 - 50,1,5- ,5 2,5-3,5 . 1:1 лизд дуне нта ресЦелью изние выходаПитательрондния бдк ликозддкто д) вьппе риктдзы Ря 1 . средд для кул) 1 з гй Ггоч)г 1 епс)д кь д рестрик гд и 1 Ря стяг игточнилов в 1 тер цент цл Питдте:и,ндл интенс и 4 ик дпин 1средз оГ ндкопл нг,: чиндеть, гр 11 з дд - проклнчлет ле(56) БщдСЬ Р,1. В 1 аГГпег Р.К., 1)лчдея .1. "ТЬе дяо 1 аГдоп апд рагдда 1сЬагасгегдгагдоп о 1 а пе)г геяггдсддоп епдопцс 1 еаяе йгощ Ргочддепсдлвсцаггдд", ), Ицс 1 едс Асдйя Кея,1976, ч. 3.,2, р. 343-353.Сгееп Р.) Неупе 1 ег Н.1., Во 1 дчаг Г., Кодгдпцег К,1 Вег 1 асЬ Р,С.,СочаггцЬдав А.А., ВасЬпап К., Кцяве 1 1).З.,Тадж К., Воуег Н.И, "А Вепега 1 щегЬой Гог гЬе рцгдГдсагдопоЕ геяГгдсгдоп епгущея". 1. 1 цс 1 едсАсдся Кея. 1978, ч. 5,7, р. 23732380.Лабораторнаяства биомассы РУтв. 03,10,81,(54) ПИТАТЕ)ЬНЛЯ СРЕДА Д КУ)ЬТ)ВИРОВЛНИЯ БАКТЕРИЙ РКОЧТ 1)ЕМСТА БТ 1)АКТ 11 - ПРОЛУИЕНТЛ РЕСТРИКТЛЗ РБТ(57) Изобретение относится к биотехнологии и клсдется состдвл питдтельных сред для культинировдния бдктерийРгочдйепсда ягцаггдд - продупентдрестриктдзы Ряг 1. 11 елыл изобретенияявляется повыщение выходд рестриктдзы Ряг 1, Питдтельндя срелд содержитв кдчестве источников углеродд глн 1 козу н количестве 1,5-2,5 г/л и ллкточу в количестве 2,5-3,5 г/л, д нкачестве питательной основы - рыбныйгидролиздт н количестве 45-50 г/л иводу до 1 л. В результате использования предложенной среды выход рестриктлзы Ряс 1 нозрдстдет с 400600 ед, /г биомдссы до 75000-80000 ел. /гбиомдссы или с 3)00 - 480 д, /л куль -турдльной жидкости дс 562500640000 ед./л культурдльной жидкостипо сравнении с известным способом.30 3 1502616ной активности, за счет чего повышается выход целевого продуктаП р и м е р 1, Питательная средасодержит, г/л:5Рыбный гидролизат 50,0Глюкоза 2,5Лактоза 3,5Вода До 1 лОживление штамма Ргочдйепсда ягиагг 1 д 17 ВКПМ Восуществляютна сухом питательном агаре (сухойпитательный агар 35,0 г/л, вода1,0 л) в чашках Петри, Инкубируют вотермокамере при 37 С в течение 1518 ч,С поверхности агара в чашках Петри культуру переносят бактериологической петлей в качалочные колбыданного состава, рН 7,4, 20Выращивают посевной материал при37 С в течение 18 ч на качалке,оФерментацию культуры проводятна питатель ной среде данного составапри следующих условиях: рН 7,4;2537 С; перемешивании 200 об/мин; подаче воздуха - 2 объема воздуха на1 объем питательной среды; выращивании до достижения оптической плотности бактериальной суспензии1,75 опт. ед, (ФЭК, фильтр У 6, кювета 0,5 см)Выход биомассы: 8,0 г/л культуральной жидкостиВыход рестриктазы РзС 1: 3580000 ед,/г биомассы, 640000 ед./лкультуральной жидкости.В предлагаемом изобретении дляопределения активности использованметод электрофореза в геле, Актив- . 40ность определяли в грубом экстрактебиомассы бактерий Ргоч 1 йепс 1 а яГцагг 11 17 ВКПМ Ви в конце выделения (после хроматографии на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой), 45За единицу активности рестриктазы Ряг 1 принимают минимальное количество фермента, которое требуетсядля полного расщепления 1 мкг ДНКо,фагав течение 1 ч при 37 С,Выделение фермента проводят следующим образом,50 г биомассы бактерий суспендируют в 100 мл 10 мМ трис-НС 1, буфера, рН 7,2, содержащем 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 1 мМ азид натрия, 1 мМтрилона Б (буфер А) и доводят этимже буфером до объема 150 мл. К суспензии добавляют 1,5 мл 10%-ного45,0 1,5 тритона Хи 150 мг лизоцима,Лизис проводятч при постоянномперемешивании, Дальнейшее фракционирование лизата проводят в системедвухфазного разделения.Полученный лизат добавляют к смеси, состоящем иэ 37,0 мл 15%-ноговодного раствора декстрана Т,56 мл 30%-ного водного раствора полиэтиленгликоля (ПЭГ) и 35 мл 4,0 Мхлористого натрия (рН смеси 6,5).Тщательно перемешивают в течение15 мин и центрифугируют на центрифуге НВЬ вреед (20000 к 1, 20 мин),Верхнюю ПЭГ-фазу объемом 120 мл, со"держащую фермент, отбирают, разбавляют двухкратным объемом буфера А,добавляют тритон Х(0,1%) и наносят на колонку с фосфоцеллюлозой,уравновешенную буфером А, содержащим 0,1%-й тритон Х(буфер Б).Фермент элюируют 0-1,0 М линейнымградиентом концентрации натрия хлористого в буфере Б, Фракции, содержащие рестриктазу Рвг. 1, концентрируют диализом против буфера Б, содержащего 557.-й глицерин,Получают очищенный фермент Рвйв виде прозрачной бесцветной жидкости.Рестриктаза Ряг 1 расщепляет ДНК-10 С в течение 1 г.П р и м е р 2. Питательная средасодержит, г/л:Рыбный гидролизат 47,5Глюкоза 2,0Лактоза 3,0Вода До 1 лВыращивание биомассы: адаптациюкультуры, инокуляцию посевного материала, ферментацию культуры проводятподобно примеру 1,Выход биомассы: 7,75 г/л культуральной жидкости,Выход рестриктазы Ряг 1:77500 ед,/г биомассы, 600625 ед,/гкультуральной жидкости.Определение активности, выделение фермента РяС 1 и хранение проводят подобно примеру 1П р и м е,р 3, Питательная средасодержит, г/л:Рыбный гидролизатГлюкоза1502616 Формула изобретения Выход рестриктаэы РзС 1:20000 ед,/г биомассы, 84000 ед./лкультуральной жидкости.Определение активности, выделениефермента Рзй 1 и хранение проводят гподобно примеру 1,П р н м е р 5. Питательная средасодержит, г/л:Рыбный гидролизатГлюкозаЛактоэаВода 52,5 3,0 4,0 До 1,0 л 45-501,5-2,52,5-3,5 До 1 л Составитель Н,ХодаревРедактор В,Данко Техред М,Дидык Корректор И.Муска Заказ 5045/35 Тираж 501 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открьггиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101 Лактоза 2,5Вода До 1,0 лВыращивание биомассы: адаптациюкультуры, инокуляцию посевного материала, ферментацию культуры проводятподобно примеру 1,Выход биомассы: 7,5 г/л культуральной жидкости.Выход рестриктазы Рзй 1:75000 ед./г биомассы, 562500 ед,/лкультуральной жидкости.Определение активности, выделениефермента РзСи хранение проводятподобно примеру 1,П р и м е р 4. Питательная средасодержит, г/л:Рыбный гидролизат 42,5Глюкоза 1,0Лактоэа 2,0Вода До 1,0 лВыращивание биомассы: адаптациюкультуры, инокуляцию посевного материала, ферментацню культуры проводят подобно примеру 1,Выход биомассы: 4,2 г/л культуральной жндкости. Выращивание биомассы: адаптациюкультуры, ннокуляцию посевного материала, ферментацию культуры проводятподобно примеру 1,Выход биомассы: 4,5 г/л культуральной биомассы.Выход рестриктазы Рзй 1:15000 ед./г биомассы, 67500 ед./л1 О культуральной жидкости,Определение активности, выделение фермента Рзй 1 и хранение проводят подобно примеру .Таким образом, в результате ис 15 пользования предложенной среды повышается вьгход рестриктаэы Рзй 1 с400-600 до 75000-80000 ед,/г биомассы или с 3000-4800 до 562500640000 ед./л культуральной жидкости20 по сравнению с известным способом. Питательная среда для культнви рования бактерий Ргоч 1 йепс 1 а зйцагС 11 - продуцента рестриктаэы РзТ 1,включающая источники углерода, аминного азота, витаминов и воду, о тл и ч а ю щ а я с я тем, что, с це лью повышения выхода рестриктазыРзй 1, она содержит в качестве источников углерода глюкозу н лактозу,а в качестве источников аминного азота и витаминов - рыбный гидролизатпри следующем количественном соотношении компонентов, г/л:Рыбный гидролизатГлюкозаЛактозаВода