401667

О П И-С А Н И 40) 667 Союз Советских Социалистицеских Реслублик;тт. Кл. С 070 51/54 с присоединением заявки ЛеПриоритетОпубликовано 12.Х.1973. Бюллетен Гасударственный комитет Совета Министров СССР па делам иэааретеиий и открытийК 54 т.857,7,07(088.8) Дата опубликования описания 271974 АвторыизобретенияК. А. Авербург, А, Вковский, В. М. Черндар жевскаяных соединений АН Грачева,нко явител ПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИГУАНИЛОВОЙ КИСЛОТ Изобретение относится к усовершенствованному способу получения полигуаниловой кислоты, которая может найти применение для биохимических, биологических и генетических исследований,Известен способ получения высокомолекулярной полигуаниловой кислоты поликонденсацией гуанозин-дифосфата в присутствии высокоочищенного фермента - полинуклеотидфосфорилазы из ЕзстегсЫа со 11 (Е. со) с удельной активностью больше 100 и солей Мп. При этом процесс протекает нормально только с дифосфатами, не содержащими начального неорганического фосфора. Однако используемый гуанозин-дифосфат легко разлагается при хранении и все продажные препараты, как правило, содержат отщепившийся неорганический фосфор и гуанозин- монофосфат. Очистка дифосфата от этих соединений технологически сложна. Кроме того, применяемый по известному способу фермент требует очень сложной шестистадийной очистки, в том числе трех стадий очистки методами колоночной хроматографии. Полигуаниловая кислота, получаемая по такому способу, является неиндивидуальным продуктом и не образует комплекса с полицитидиновой кислотой без дополнительной очистки.С целью упрощения процесса по предлагаемому способу в качестве фермента используют частично очищенную полинуклеотидфосфорилазу с удельной активностью больше 1.Применяемый гуанозин-дифосфат можетсодержать до 25% неорганического фосфора, 5 Поликонденсацию целесообразно проводитьв присутствии мочевнны, например, при концентрации 0,4 Л.Применяемый по предлагаемому способуфермент очищают в три стадии, исключая 10 колоночную хроматографию. Поскольку длясинтеза полигуаниловой кислоты используют малоактнвныи фермент, то полимер может содержать значительные примеси белка, для очистки от которого проводят дополнительную 15 депротеинизацию полимера смесью изоамиловый спирт - хлороформ.Выход целевого продукта достигает 50%при использовании гуанозин-дифосфата, не содержащего примесей неорганического фос фора, и 30 - 40% при содержании последнего15 - 25%.Лиофильно высушенная полигуан илов аякислота белого цвета не содержит нуклеотидных примесей, имеет молекулярный вес более 25 300000, не содержит примесей олигогуаниловой. и низкомолекулярной полигуаниловой кислот и образует комплекс с очищенной по лицитидиновой кислотой.П р и м е р 1. 40 мл реакционной смеси, 30 содержащей 23 мг (400 мкмоль) гуанозин401667 Составитель В. ЖесткойРедактор 3. Горбунова Техред Т. Миронова Корректор Т. Гревцова Заказ 408/17 Изд.159 Тираж 523 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий Москва, Ж.35, Раушская наб., д. 4/5Типография, пр, Сапунова, 2 3дифосфата фирмы Са 1 Ь 1 ос 11 епт, 4 мл 1 М трис-НС 1-буфера (рН 8,5), 4 мл 0,02 М Мп 804, 40 ед. активности полинуклеотидфосфорилазы из Е. со 11 третьей стадии очистки (фракция насыщена 34 - 43% сульфата аммония, уд. активность 2,28) и 32 мл бидистиллированной воды, инкубируют при 60 С. За ходом поликондексации следят по приросту неорганического фосфора в зависимости от времени. Реакцию заканчивают через 5 час, Прирост неорганического фосфора 59%,Для выделения полигуаниловой кислоты реакционную смесь, охлажденную до 0 С, дважды экстрагируют при 0 С равным весовым количеством 90%-ного раствора свежеперегнанного фенола в 0,1 М трис-НС 1-буфере (рН 7,4). Фенольный слой отделяют от водного центрифугированием в течение 40 мин при 0 С и 15000 д. Затем фенольный слой 4 раза промывают 0,1 М трис-НС 1-буфером с целью удаления полигуаниловой кислоты. Объединенный водный слой обрабатывают при 0 С смесью изоамиловый спирт - хлороформ (1: 2,5), используя на каждые 10 мл водного раствора 3,5 мл смеси, Следы фенола удаляют эфиром, полигуаниловую кислоту высаживают из водного раствора двукратным объемом спирта с кристалликами хлористого натрия и выдерживают в холодильнике в течение ночи, Выпавший осадок отделяют центрифугированием, растворяют в минимальном объеме 0,1 М трисНС 1-буфера, диализуют в 2,5 л 0,2 М раствора хлористого натрия, содержащего 0,001 моль ЭДТА, трижды в бидистиллированной воде и лиофилизуют. Выделяют 213 мкмоль полигуаниловой кислоты. Выход 50%. 4П р и мер 2. 30 мл реакционной смеси, содержащей 172 мг (330 мкмоль) гуанозин- дифосфата фирмы Реанал (примесь неорганического фосфора 18,6/о), 3 мл 1 М трис-НС 1- 5 буфера (рН 8,5), 3 мл 0,02 М Мп 304, 793 мгмочевины, 30 ед, активности полинуклеотидфосфорилазы из Е. со 11 третьей стадии очистки (фракция 34 - 43% насыщения сульфатом аммония, уд. активность 2,28) и 24 мл биди стиллированной воды, инкубируют при 60 С.За ходом поликонденсации следят по приросту неорганического фосфора в зависимости от времени. Реакцию заканчивают через 5 час, Прирост неорганического фосфора 65%.15 Полигуаниловую кислоту выделяют по примеру 1. Получают 121 мкмоль полигуаниловой кислоты. Выход 38%. 20 Предмет изобретения 1, Способ получения полигуаниловой кислоты поликонденсацией гуанозин-дифосфата в присутствии фермента - полинуклеотидфос форилазы из Езс 11 ег 1 сЫа со 11 и солей Мп споследующим выделением целевого продукта известным способом, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса, используют частично очищенную полинуклеотидфосфорилазу 30 с удельной активностью больше 1.2. Способ по п. 1, отличающийся тем, чтогуанозин-дифосфат содержит до 25% неорганического фосфора.3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что 35 поликонденсацию проводят в присутствии мочевины.