Способ получения иммобилизованного н-градиента для изоэлектрического фокусирования белков

госхдАРотвЕнный-номитет по изоБРЕтЕниям и открытиям при пчнт сссе(71) интиТУТхиМи АН ЭССР А. (57) Изобретение относится к получеи Институт экспериментальной биологии ню иммдбидизованного рнграднента АН ЭССРОдля изоэлектрического фокусирования(55)С 1 аа 32 а Е- И дР- РГ 9 РаГаП 05 - и упрощение процесса. Получение ведут 1 ШЬ 11 ед РН 8 Тад 19 П 5 ЭРЗПППЗ путем введении в полимериэуемую смесь,2-6 рН цп 1 св у 1:Ьтсио-сьатьег т 1 хегв:содержащую акриловый Мономер, ициа еуа 1 цес 1 оп 05 сто ехрег 1 шепса 1 аррго тор полимриэации и акридамид (ы)3 ти асъее. Е 1 ессгорЬоге 1 з, 1984, ; ленсульфоновую кислоту, акриламидо8897-О тетраэтилентетраммн. Процесс идет л в две стадии против восьми по известному способу. 2 ил.получения иммобилизованного рНграН 2 С=СН -СНН-СН 1-СН 2)4 ЫН,днента для изоэлектрического фокуси-рования белков, которьй может найти15 УФеРИРУЮЩИЙ В ШИРОКОМ диапазоне применение в биохимии; РН (ОТ 3 до 10)дЦель изобретенияповышение не ДЛЯ СОЗДЗНИЯ ИММО 5 ИЛИЭ 0 ВаНН 0 Г 0 дежности получения линейного иммоби- РНГРадИеНТа ИСПОЛЬЗУЮТ дВУХКаМеРд лиэованного рН-градиента шрокогоНЫЙ ГРЗДИЭНТНЬЙ Смеситель, В ОДНУдиапазона, упрощение и удешевление ИЗ КЗМЕР КОТОРОГО ВНОСЯТ РЗСТВОР технологии его получения. КОНЦЗ ОСНОВНОГО СОСТаВа а В ДРУНа фиг.1 изображена кривая титро ГУЮ - РЗСТВОР конца кислого состава вания акриламидопентаэтиленпентамина 4 ФОРММРУЗМОГО Градиента.(2); на фиг.2 - кривая титрования рн 7.0 иммобилина. П р и м е р. Формированисмеси акриламида (28,8 вес.Х/объем) е иммоби с бнсакриламмдом (1,2 вес.Х/объем),лизованного рНградиеита в полиакрн-40 мкэкв, АТЭТА т.е. 2,43 мг,ламмдном геле, где в качестве буфе мол.вес 243 и 4 мкзкв. акриламидо црирующево компонента использован этиленсульфоновой кислоты (АЭСК),акриламидотетраэтилентетраммн-(АТЭТА): Т-е МКТ-МОП-ВеС-4Добавляют до 3500 мкл воду и 25 мкл 10%ного, Ы,Ы М, Ытетра Ч метилэтилендиамина (ТЕМД), доводят рН до 7,0, добавляют 20 мкл 102 ного рствора персульфата амония-и доводят объем раствора до 4000 мкл.Кислый, тяжелый раствор: 1000 мкл 20%ного глицерина, 530 мкл смеси акриламида (28,8 вес.%/объем) с биса 1 д криламидом (1,2 вес.%/объем)ь40 мкзкв, АТЕТА т.е. 2,43 мг, и 36 мкэкв. АЭСК т.е. 6,44 мг.Добавляют до 3500 мкл воду и 025 мкл 10%ного ТЕМЕД, доводятрН до ,5 7,0, добавляют 20 мкл 10%ного раствора персульфата аммония И доводят объем раствора до 4000 мкл.Градиент перемешивают в течение 3-8 мин при комнатной температуре, 20 оставляют для уравновешвания при той же температуре на 15 мин и затем осуществляют полимеризацию н термот стате в темноте при 5000 в течение 60 мин. Полученный гель толщиной 25 0,5 мм отмывают от незаполимеризо вавщихся компонентов сначала в тече ние 1 ч в 1 л воды, затем еще в течепне 1 ч в 1 л 1%ного глицерина и,наконец, сушат при комнатной температ 30 туре. Выход геля, установленный экспериментально, составляет практически 100% Необеэвоженньй гель может хранитьсялри 490 в герметичной упа ковке (например; в полиэтиленовом епакете) в течение нескольких недель(не менее 2-3). Высушенный же гель в тех же условиях может хранитьсяв течение нескольких месяцев (не менее 56)..Перед использованием сухому гелю дают набухнуть в течение 2 ч в ячейке,содержащей только воду или при необ.ходимости, водувключающую антиконвекционные компонентысахарозу,глицерин и т.п. а также амфолитыПри осуществлении предлагаемого способа достигается упрощение технологии получения рН за счет сокраще. ния числа исходных компонентов(2 вместо 8, кроме входящих в полимериэационную смесь геля), удешевляется процесс за счет применения Ы недорогих и доступных исходных ком 0 понентов (буферирующего ититранта) повышается надежность получения линейногоиммобилизованного рПградиента: изменяется лишь утол наклона,но не характер (форма) кривой титро 0 ВЗНИЯ оСпособ получения иммобилизованного рНградиента для изоэлектрическогофокусирования.белков в полиакриламид ном геле путем введения в полимеризуемую смесь, содержащую акриловый мономер, инициатор полимеризации н титрующнй компонент, буферирующего. компонента и последующей полимеризации, о т л и ч а ющ И й ся тем,что, с целью расширения диапазона рНградиента и упрощения процесса, в качестве буферирующего компонента используют акриламидотетраэтилен тетрамин, а в качестве титрующего компонентаакриламд (Н)зтиленА сульфоновую кислоту.