Способ исследования хромосомного состава клеток

СВОЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ.РЕСПУБЛИК 09) (И)151) 4 С 01 33 483 АРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ ПО ИС ТЕНИЯ К АВТОРС(54) (57) СПОСОБСОМНОГО СОСТАВАшения клеток с.пцией импульса ф(21) 35 (22) 11 (46) 23 (71) Ле физики (72) С. (53) 61 ИЕ ИЗОБ СВИДЕТЕЛЬСТВ 7845/28-1401.8309.87. Бюл. У 35инградский институт ядернойим. Б,П.Константинова.07 (088.8) ИССЛЕДОВАНИЯ ХРОМО- КЛЕТОК путем разруоследующей регистралуоресценции каждой хромосомы, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что, с целью повышения информативности способа за счет поклеточного анализа хромосом, разрушение клеток проводят пропусканием их черезкапилляр диаметром, соответствующимдиаметру клетки, далее регистрируютинтервалы времени между импульсамифлуоресценции и по величинам интервалов 3-10 мс между импульсами определяют хромосомы, принадлежащие одной клетке.15 20 25 30 35 40 45 50 55 Изобретение относится к областиавтоматизированного анализа биологических микрообъектов, в частности кспособам быстрого анализа хромосомного состава клеток,Целью изобретения является повышение информативности способа за счетпоклеточной регистрации хромосом,Способ осуществляют следующим образом.При пропускании потока клеточнойпробы клетки проходят через устройство разбиения. В простейшем случае онопредставляет собой капилляр, в кото -ром клетки разбиваются гидродинамическими силами. Для этой цели возможно также использование ультразвукового облучения, В устройство разбиенияклетки поступают поочередно. Это достигается уменьшением их концентрациив суспенэии и уменьшением расходаклеточной жидкости до тех пор, покавероятность одновременного поступления двух клеток не станет пренебрежимо мала. На выходе из устройства разбиения появляются группы хромосом,принадлежащие отдельным клеткам иидущие друг за другом с некоторым пе, рерывом. Далее хромосомы проходят капилляр, в котором происходит увеличение расстояния между хромосомами вгруппе (длины группы), чтобы регистрирующая электроника успевала заре -гистрировать все хромосомы, Временное распределение клеток, поступающих в устройство разбиения, представляет собой распределение Пуансона.Плотность распределения временныхпромежутков между клетками (также междугруппами хромосом) есть Р=Техр (-/Т), где Т - среднеевремя между прохождением клеток. Распределение хромосом внутри группытакже примерно представляет собойраспределение Пуансона, Соответствен -но плотность распределения временныхпромежУтков между хромосомами внутригруппы есть Р(ь)=Т ехр(-Т/Т )угде Т - среднее время между хромосомами в группе. Из капилляра поклеточные группы хромосом поступают впроточную систему цитофлуориметра.Флуоресценция хромосом и время междуними анализируются с помощью регистрирующей системы. Начало поступленияхромосом от очередной клети определяют на основе того, что среднее времямежду прохоя;дением групп Тбольше в 30-3000 раз, чем среднее время между хромосомами внутри группы. Для этого одновременно с регистрацией флуоресценции хромосом тем или иным способом регистрируют и время между импульсами . По спектру распределения времени между импульсами, содержащему оба временных распределения, выбирают такое граничное время Т, , которое больше, чем времена внутри группы и меньше, чем времена между группами. Примерно оно выбирается как у, = 1 Т Т, . При определении групп хромосом, принадлежащих определенной клетке, первой хромосомой является та., которая пришла через время, боль - шее, чем ТСпособ поясняется конкретными примерами.П р и м е р 1. Метафазные клетки китайского хомячка линии СНЕ 1. подвер - гают предварительной обработке с целью окраски и облегчения последующего разрыва клетки и расхождения хромосом . Клетки в суспензии выдерживают для набухания в гипотоническомрастворе (75 мМ КС 1) 20 мин. Затемих обрабатывают раствором состава: де -тергент УГритон "Х" -ОуЗЕ, 1 мММяС 1, 1 мМ СаС 1 : 20 мг красителяэтидий бромид, 25 мМ КС 1 р 25 мМТгдз-НС 1, Раствор имеет рН=7,0 .Времяобработки 15 мин. Затем клеточную суспензию с концентрацией не более 10000 клеток в мл осторожно, не допуская преждевременного разрыва их, заливают в насос проточного цитофлу - ориметра. Из насоса поступает 20- 50 клеток в, с. Далее клетки проходят через устройство разбиения, представ -ляющее собой капилляр диаметром 100150 мкм, длиной 50 мм. Затем подклеточные группы хромосом проходят через капилляр длиной 60 мм, диаметром0,3 мм. Капилляр увеличивает длинугрупп (среднее время между хромосомами внутри группы при этом увеличивается до 0,1 мс), Затем хромосомыпоступают в проточную систему цитофлуориметра, флуоресценция, пропорциональная количеству ДНК в хромосоме, поступает на систему регистрации . Одновременно этой систеМой также. регистрируется время между импульсами, Из распределения времени междуимпульсами определяется граничноевремя Т, , Здесь оно составляет 3 мс.Регистрирующее устройство производит76 Составитель М.ВасильевРедактор П.Горькова. Техред М.Дицык Корректор С. 1 Чекмар Заказ 4358 Тираж 776 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д .4/5Производственно-полиграфическое предприятие,г.Ужгород,ул.Проектная,4 з 12006 также подсчет хромосом в каждой клетке. Подсчет хромосом в очередной клетке начинается с хромосомы, время прихода которой по отношению к5 предыдущей превышает граничное время (3 мс) и оканчивается той хромосомой, следующая за которой приходит через время, большее, чем граничное. Регистрирующая система, используемая 10 здесь, состоит из амплитудного анализатора и набора стандартных электронных блоков.Анализ распределения числа хромосом в клетках, описанный в этом примере, производится со скоростью 20- 50 клеток в с и не может быть выполнен другими известными техническими средствами, например по способу прототипа.20П р и м е р 2. Метафазные клети китайского хомячка линии СНЕЬ подвергают предварительной обработке, выполненной так же, как в первом примере. Клеточную суспензию готовят в 25 концентрации 5000 клеток в мл. Из насоса подают 30-100 клеток в с. Далее суспензию пропускают через устройство разбиения, представляющее собой капилляр длиной 40 мм, диаметром 30 100 мкм, внутри которого помещена спираль диаметром 100 мкм. Затем под-. клеточные группы проходят через капилляр диаметром 0,2 мм, длиной 100 мм, в котором осуществляется растяжка длины групп. Импульсы флуоресценции и время между ними регистрируются устройством. Регистрация в данном примере происходит не в виде спектра, а в виде последовательно заполняемых ячеек памятиИмпульсы флуоресценции хромосом, записанные последовательно по мере их прихода, объединяют в группы, соответствующие хромосомам отдельных клеток. Для этого строят распределение времен между импульсами и выбирают граничное время Т, аналогично примеру 1. Импульсы флуоресценции, отделенные друг от друга временем большим, чем граничное, относятся к разным клеткам. В данном примере граничное время составляет 10 мс, Таким образом выделяют группы, в которые включены хромосомы, принадлежащие отдельным клеткам, Из работ по проточной цитофлуориметрии известно, что каждая хромосома располагается на спектре в определенной области флуоресценции. Любые отклонения от этих пределов представляют хромосомные аномалии . Таким образом, если флуоресценция от хромосом попала за пределы этих областей, или внутри области находится лишнее количество хромосом, это указывает на регистрацию аномальных хромосом. В результате этой обработки получается такая информация, как число клеток в пробе с тем или иным числом хромосомных повреждений . Практически это очень важно, так как адекватно характеризует действие, которое оказывают радиоактивные излучения и мутагенные вещества на генетический аппарат клетки,