Способ получения сульфатов пептидил-аргининальдегидов

) ГОСУДАРСТВЕННЫИ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ ОПИСАНИЕ ИЗ(71) Рихтер Гедеон Вепьесети ДРТ (Н 13)(57) Изобретение касается производных пептидов, в частности получения сульфатов пептидил-аргининальдегида (СП). Цель - создание новых активных веществ пептидной природы сселективным торможением свертываниякрови. Синтез СП общей ф-лы: К К -. -РРЬе-Рго-А-Н Н 80, где К, - Н; К - С, -алкил; К 1 и К присоединены к НН-группе 0-фенилаланина; А - остаток Ь-аргинина, ведут конденсацией аргинин-лактама с защищенной гуанидиновой группой и защищенного по концевой аминогруппе дипептида И-моноалкил (С )-1 -пролина, Полученный трипептидлактам восстанавливают до альдегида и после отщепления защитных групп выделяют целевой продукт в виде сульфатной соли.6 оВыход, %: К , 1 Ы 1 в, брутто-ф-па: а) 75; О,39-0,47; (-131); С НЯМ х 7/8 (Н БО) 2,5(НО); б) 7 д; 0,4- 0,5; нет; СЩЭМ 5/6 (Н 1804 )3,5(НО); в). 80; 0,64; нет;С,Н,Н, Н,БО, 4(Н,О); д) 67; 0,85- 0,7; нет. Новые СП проявляют антитромбиновую активность (в сравнении с контролем в пять раз увеличивается время свертывания), оказывают влияние на плазминфибриновую реакцию, стабильны во времени, а их минимально активная доза 1-2 мг/кг.3 табл.плазмина в 0,1 мл буферного раствора (КАВ 1, Стокгольм, 1 веция).Время свертывания образовавшегося в системе фибринозного геля бездобавления пептида 10 мин,В качестве .контрольного соединения применяют сульфат Э"фенилаланин-Ь"пролил-Ь"аргининальдегида, атакже гемисульфат трет-бутилоксикарбонил-Э"фенилаланин-Ь-пролил-Ь-аргининальдегида.Действие трипептидальдегидов наплаэминфибриновую реакцию показанов табл. 2 (время растворения фибринозных сгустков без добавления пептида 10 мин).Иэ приведенных в табл. 2 данныхвидно, что И-алкилированный трипептидальдегид ведет себя как известный, содержащий свободную расположенную на конце аминогруппу. При ма"лых количествах образовавшиесясгустки растворяются в течение контрольного времени, при больших количествах сгустки либо вообще не образуются, либо образуются со слабойгелевой структурой. Одновременногемисульфат ацилтрипептидальдегидав зависимости от концентрации удлиняет время гидролиза плазмина фибринозных сгустков.Из описанных исследований следует, что новые трипептидальдегиды салкилированными концевыми амйногруппами обладают. значительно большейстабильностью чем известный суль 9фат Э-фенилаланин-Ь-пролил-Ь-аргининальдегида, но одновременно онипредставляют собой аналогичные се"лективные замедлители свертывания,поскольку они не оказывают влиянияна плазминфибриновую реакцию.Новые Ю-алкилтрипептидальдегидыпредлагаемой формулы обладают п ч.чо значительной тормозящей свертывание крови активностью. При проведе"нии исследований пептиды вводятвнутрь через рот или внутривенно новозеландским зайцам (вес 2-3 кг),причем пептиды вводят в физиологическом растворе соли. При внутривенном введении, в течение 3 ч вливания с дозами 0,5-2,0 мг/кг/ч введения производят со скоростью 6 мл/ч.Через рот вводят внутрь 20-30 мг/кгпептида, растворенного в объеме2 мл. После введения с интерваламив 30 мин из каудальной вены отбирают пробы крови, после чего в тромбоэластографе определяют время свертывания всей крови, одновременно такжеизмеряют время плазма-тромбиновойреакцииТормозящее свертывание в живоморганизме действие М"алкилтрипептидальдегидов в опытах на самцах ново"зеландского зайца показано в табл. 3.Приведенные в табл. 3 данные показывают, что М"алкилтрипептидаль"дегиды обладают равной или близкойактивностью по сравнению с веществом, примененным для сравнения.На основании исследований по внутривенному вливанию, осуществленныхна зайцах, установлена доза для человека при внутривенном введении,составляющая 1-2 мг/кг/ч.Проведенные испытания показывают, что Н-алкильные (С-С 4)-производные сульфатов пептидилальдегидов в течение периода наблюдения не"значительно теряют свою первоначальную активность (И-этильные и И-изо"бутильные производные теряют активность на 15-20 ), в то время каксоединение сравнения деэактивируется за этотпериод на 60%.Кроме того, новые трипептидальде"гиды с алкилированными концевымиаминогруппами более стабильны, чемизвестный сульфат Э-фенилаланин-Ьпролил-Ь-аргининальдегида, но одно временно они представляют собой ана"логичные селективные эамедлителисвертывания, поскольку при эффективном торможении тромбин-фибриногено"вой реакции они не оказывают влия ния на плазминфибриновую реакцию.Формула изобретенияСпособ получения сульфатов пеп тидил-аргининальдегидов общей формулыгде К- водород;К- С,-С 4"алкил, причем К и Кприсоединены к аминогруппеЭ"фенилаланина; сг5.) А " остаток Ь-аргинина,о т л и ч а ю щ и й с я тем, чтоаргинин-лактам с защищенной гуанидиновой группой конденсируют с эащи"1384203 20 9 ветствующего трипептидальдегида ипосле отщепления защитной группыцелевые продукты выделяют в видесоли,щенным ло концевой аминогруппе дипептидом И".моноалкил(С -С)-Ь-пролином, полученный защищенный трипептидлактам восстанавливают до соотТаблиц а 1 Начальная Пептидальдегид активность,3+Концентрация пептида в реакционной смеси (рМ), которая в сравнении с контрольным опытом вызывает пятикратное удлинение времени свертывания. Таблица 2 10 0,18 Сульфат М-метил-Р-фенил- аланин-Ь-пролил-Ь-арги- нинальдегида 0,36 0,72 Нет сгустков Сульфат И-метил-Р-фенилаланин-Ь-пролил-Ь-аргининальдеСульфат И-изобутил"-Ь-пролил-Ь-аргининальде"гида 0,18 1 О 0,3 б 0,72 Нет сгустков 0,18 Гемисульфат трет-бутил-,оксикарбонил-Р"фенил"аланин"Ь-пролил"Ь-аргинин"альдегида 0,3 б 20 0,72 40 Время растворения нельзя измерить, сгустки имеютслабую структуру Таблица 3 Трипептидальдегид Наименьшая активная доза, мг/кг/ч Внутри- Черезвенно рот Сульфат И-метил"Р-фенилаланин-Ь-пролил-Ь-аргининальдегида 0,5 20 Сульфат И-этил"Р-фенилаланин-Ь-пролил-Ь-аргининальдегида 20 Сульфат И-изобутил"Изобретение относится к способу получения сульфатов пептидил-альдегидов - новых биологически активных соединений, которые могут найти применение в медицине.Цель изобретения - создание новых соединений пептидной природы, обладающих селективным торможением свертывания крови, но более ста-. бильных и не проявляющих склонности к необратимой циклизации.К -значения определяют с помощью хроматографии в тонком слое на силикагеле (К 1.езе 1 де 1 С "Реанал", Будапешт) при применении в качестве элюирующего средства смеси растворителей. Этиловый эфир уксусной кислоты, пиридин, уксусная кислота и вода при соотношениях (960:20:б:11); (480:20:6:11); (240:20:6;11); (120: : 20: 6: 11) 1 (60: 20: б: 1 1); (30: 20: б: :11).П р и м е р 1. Сульфат Б-метил- -0-фенилаланин-Ь-пролил-Ь-аргининальдегидаСтадия 1. М-Бензилоксикарбонил-Б-метил-П-фенилаланин-Ь-пролил-И - -бензилоксикарбонил-Ь-аргинин-лактам.42,95 г (0,11 моль) И-трет-бутилоксикарбонил-И -бензилоксикарбонил-Ь-аргинин-лактама суспендируют в 110 мл безводного хлороформа, пос" ле чего суспензию при перемешивании смешивают с 275 мл раствора хлористого водорода в этиловом эфире уксусной кислоты (концентрация 0,11- 0,15 г/мл), После перемешивания в течение 3 ч реакционную смесь разбавляют прибавлением 400 мл диэтилового эфира, выделившуюся в осадок кристаллическую массу отфильтровывают, два раза промывают осадок диэти-. ловым эфиром, применяя каждый раз по 100 мл последнего, а затем промывают два раза ацетоном, применяя каждый раз по 50 мл последнего. Затем продукт сушат в вакуумном эксикаторе над пятиокисью фосфора и гидро- окисью калия. После сушки приблизительно в течение 1 ч соединение растворяют в 100 мл диметилформамида, приготовленный раствор охлаждают до -15 С, после чего при указанной температуре и при перемешивании прибав-, ляют в раствору сначала 20 мл, а затем 10-15 мл триэтиламина таким образом, чтобы в газовой фазе нельзя50 55 Полученный маслообразный остаток растворяют в 60 мл смеси, состоящей иэ бензола и тетрагидрофурана (8:2), после чего раствор хроматографиру- ют на колонке, заполненной 750 г силикагеля-бО, при применении в качестве элюирующего средства той же самой смеси растворителей, Фракции анализируют с помощью хроматографии в тонком слое на силикагеле при применении в качестве элюирующего средства смеси растворителей, состоящей было обнаружить перетекание основания. Ссупензию прибавляют к указанному ниже смешанному ангидриду.50,9 г (0,1 моль) циклогексиламмонийной соли Н-бензилоксикарбонил-М-метил-фенилаланин-Ь-пролинарастворяют в 200 мл диэтилового эфира и 120 мл 1 н. раствора сернойкислоты. Фазу диэтилового эфира трираза промывают водой, применяя каждый раз по 30 мл последней, сушатнад безводным сернокислым натрием, азатем упаривают на водяной бане при40 С и давлении 25-30 мбар, Полученный остаток и 11,2 мл (0,1 моль)И-метилморфолина растворяют в 70 млдиметилформамида, раствор охлаждают до -15 С, после чего при указано20 ной температуре смешивают с 13,2 мл(0,1 моль) изобутилоксикарбонилхлорида, Затем (через 3-5 мин) смесьдополнительно перемешивают в течение 5 мин, после чего к полученному 25: смешанному альдегиду прибавляют ука-занную суспензию в диметилформамиде. Реакционную смесь перемешиваютв течение 1 ч при -15 С и в течение 1 ч при 0 С, затем смесь разбавляют прибавлением 200 мл бензола,после чего выделивашийся в осадоккристаллический продукт отфильтровывают.Раствор продукта в бензоле и диметилформамиде разбавляют прибавлением 150 мп воды, после чего производят разделение фаз. Нижнюю, содержащую воду,. диметилформамидную фазутри раза экстрагируют бензолом, применяя каждый раз по 50 мл последнего, Объединенные бензольные растворытри раза промывают водой, применяякаждый раз по 30 мл последней, сушат над безводным сернокислым натрием, а затем упаривают на водяной 45бане при температуре, составляющеймаксимум 40 С, и давлении 20-25 мбар.из этилового эфира уксусной кислоты, пиридина, уксусной кислоты и воды 480;20:6:11. Целевой продукт имеет К -значение 0,70-0,76. Фракции, в которых содержится чистый основной продукт, объединяют и упаривают на водяной бане при температуре, составляющей максимум 40 С, и давлении 20-25 мбар до объема 100 мп. Полученный концентрат смешивают с 500 мл петролейного эфира. Образовавшуюся суспензию фильтруют, остаток на фильтре два раза промывают петролей.Ным эфиром, применяя каждый раз по100 мл последнего, и затем сушат в вакуум-эксикаторе над серной кислотой и парафиновыми стружками.Выход 45 г (65 ),ГЫ 3 ", = +13,.5-пролил-И -бензилоксикарбонил-Ь-аргинин-лактама (пример 1, стадия 1) растворяют в 150 мл тетрагидрофурана, после чего приготовленный раствор при перемешивании смешивают с 0,0375 моль литийалюминийгидрида в тетрагидрофуране, Процесс восстановления контролируют с помощью хроматографии в тонком слое при применении в.качестве элюирующего средства смеси растворителей, состоящей изэтилового эфира уксусной кислоты, пиридина, уксусной кислоты и воды 45 240:20:6:11, (К- значения для лактама и альдегида составляют соответственно0,80,5). В случае необходимости прибавляют дополнительное количество литийалюминийгидрида. Затем при перемешивании и охлаждении50РН реакционного раствора доводятдо значения 2 посредством прибавления 1 н. раствора серной кислоты.Раствор разбавляют водой до появления опадесценции (приблизительно 300 мл), а затем два раза производятэкстрагирование гексаном, применяя каждый раз по 100 мл последнего. Содержащий воду, тетрагидрофурановый раствор два раза экстрагируют при применении 250 мл метиленхлорида, объединенные метиленхлоридные экстракты последовательно промывают два раза водой, применяя каждый раз по 50 мл последней, два.раза 5 -ным раствором кислого углекислого натрия, применяя каждый раз по 60 мл этого раствора, и вновь два раза водой, применяя каждый раз по 50 мл последней, сушат над безводным серно- кислым натрием, а затем упаривают на водяной бане при температуре, составляющей максимум 40 С, и давлении 20-25 мбар до объема 50-60 мл. Остаток смешивают со 100 мл бензола, а затем упаривают описанным способом. Полученный остаток разбавляют прибавлением 100 мл циклогексана, образовавшийся осадок отфильтровывают, промывают два раза циклогексаном, применяя каждый раэ по 30 мл ,последнего, а затем сушат в вакуумэксикаторе над парафиновыми стружками.Выход 27 г (70%) продукта, который в соответствии с данными элементного анализа, содержит 1 моль циклогексана. Кэ = 0,52-0,62. ЫЗЗ= +16,8(с = 1, тетрагидрофуран) .Вычислено,: С 67,16; Н 7,34; Б 10,93.С Н О,ИС Н, (768,93)Найдено, %: С 66,6; Н 7,2; И 10,4.Стадия 3. Сульфат И-метил-П-фе- нилаланин-Ь-пролил-Ь-аргининальдегида.23,1 г (0,03 моль) Н-бензилоксикарбонил-И-метил-Р-фенилаланин-Ь - -пролил-Ю -бензилоксикарбонил-Ь-ар- . гининальдегида (пример 1, стадия 2) растворяют в 150 мл этилового спирта. Приготовленный раствор смешивают с 50 мл обессоленной ионированием воды, 48 мл 1 н. раствора серной кислоты и 3 г 10 Х-ного палладия на угле, применного в качестве катализатора, и производят гидрирование Процесс гидрирования контролируют с помощью хроматографии в тонком слое при применении в качестве элюирующего средства с 1.си растворителей, состоящей иэ эч;чового эфирауксусной кислоты, пирцина, уксусной кислоты и воды в ыотношении10 20 ЗО 30: 20:Ь:11 (К- значения исходногосоединения 0,9, промежуточного продукта 0,7 и конечного продукта 0,4).После завершения реакции катализа 5тор отфильтровывают и промывают еготри раза обессоленной ионизированиемводой, применяя каждый раз по 30 млпоследней. Объединенные фильтрат иполученную при промывке жидкостьупаривают на роторном испарителе дообъема 100 мл. Водный остаток разбавляют обессоленной ионированиемводой приблизительно до 200 мл. Если значение рН не находится в пределах между 6,0 и 6,5, то его приводят к этому пределу посредством прибавления О,1 н. раствора серной кислоты, ионообменника в ОН-Форме (например, АС ЬХ 8), Непосредственнопосле этого осуществляют лиофилизацию,Выход 12,4 г (75%) . К = 0,390,47Го 3 ,= -131 (с = 1, вода).Вычислено, %: С 46,07 Н 7,13; 25Х 15,35; 8 5,12,СНО,11, 7/8 (НВО,) 2,5 (Н,О)(547,37)Найдено, %: С 46,4; Н 7,2;И 15,05 8 5,0.Исходные вещества получают следующим образом,Н-Бензилоксикарбонил-И-метил-Рфенилаланин-Ь-пролин.Стадия А. 2,4,5-Трихлорфениловый эфир бензилоксикарбонил-Р-фенилаланина.Ъ60,0 г (0,2 моль) бензилоксикарбонил-Р-фенилаланина и 39,4 г(0,2 моль) 2,4,5-трихлорфенола растворяют в 200 мл тетрагидрофурана,раствор охлаждают до 5-10 С, послечего охлажденный раствор при переме шивании смешивают приблизительно втечение 30 мин с 41,2 г (0,2 моль) 4,.45дициклогексилкарбодиимида, затемреакционную смесь перемешивают в течение 6 ч без охлаждения, Выделившийся в осадок дициклогексилкарбамид отфильтровывают, три раза промывают его тетрагидрофураном, применяя каждый раз по 50 мл последнего, и объединенные тетрагидрофурановые растворы упаривают в вакууме,Полученный остаток перекристаллизовывают из горячего этилового спирта,кристаллический продукт отфильтровывают, два раза прЬмывают при 5-10 ОСэтиловым спиртом, применяя каждый раз по 50 мл последнего, и сушат в вакуум-э ксикаторе.Выход 72 г (75%), т. пл. 139- 141 С, Ге 1, = +37 (с = 1, диметилформамид).Вычислено %: С 57,70; Н 3,79; И 2,921 С 1 22,22.С Н, ОМС 1 (478,75)Найдено, %: С 57,7; Н 3,9; Н 3,01 С 1 22,2.Стадия В. Бензилоксикарбонил-Р- -фенилаланин-Ь-пролин.71,8 г (0,15 моль) 2,4,5-трихлорфенилового эфира бензилоксикарбонил-Р-фенилаланина (пример 1, стадия А) растворяют при перемешивании и комнатной температуре в 180 мл безводного пиридина, а затем приготовленный раствор смешивают с 17,3 г (0,15 моль) Ь-пролина и 21,0 мл (0,15 моль)триэтиламина. Перемешивание продолжают до полного растворе-. ния Ь-пролина. Затем реакционную смесь выдерживают в течение 4-6 ч, непосредственно после этого ее упаривают до объема 80-100 мл на водяной бане при температуре, составляющей максимум 40 С, и давлении 13- 20 мбар, после чего остаток смешивают с 250 мл воды и 90 мл диэтилового эфира. Водную фазу два раза экстрагируют диэтиловым эфиром, применяя каждый раз по 30 мл последнего, объединенные эфирные растворы два раза промывают 5%-ным раствором кислого углекислого натрия, применяя каждый раз по 30 мл этого раствора, а затем объединенные водные растворы подкисляют до рН 2 посредством прибавления 3 н. раствора соляной кислоты. Выделившееся в осадок маслообразное вещество три раза экстрагируют зтиловым эфиром уксусной кислоты, применяя каждый раз по 120 мл последнего, объединенные растворы продукта в этиловом эфире уксусной кислоты три раза промывают водой, применяя каждый раз по 40 мл последней, сушат над безводным сернокислым натрием, а затем упаривают на водяной бане до 50-100 мл при температуре, составляющей максимум 40 С, и давлении 15-20 мбар. Полученный остаток перекристаллизовыва-. ют из 200 мл диэтилового эфира. Кристаллический продукт отфильтровывают, два раза промывают диэтиловым эфиром, применяя каждый раз по40 мл последнего, и сушат на воздухе,Выход 50,4. г (85 ). Т. пл. 132133 С. Г 7 и = -46,4 (с = 2, диметилформамид), К = 0,5.Вычислено, %: С 66,65; Н 6,101Х 7,07С 2,НОМ (396,43)Найдено,.; С 66,4; Н 6,25,ОМ 7,2.Стадия С. Циклогексиламмонийнаясоль Н-бензилоксикарбонил-И-метил-П-фенилаланин-Ь-пролина.39,6 г (0,1 моль) бензилоксикар.бонил-Р-фенилаланин-Ь-пролина (пример 1, стадия В) и 50 мл (0,8 моль)иодистого метила растворяют в 300 млбезводного тетрагидрофурана. Приготовленный раствор охлаждают до 0 С 20после чего при перемешивании при-.бавляют к нему порциями 13,2 г(0,3 моль) гидрида натрия, причемколичество порций составляет 8-10,затем перемешивание продолжают прикомнатной температуре в течение 2 ч.Непосредственно после этого к реакционной смеси прибавляют 500 мл этилового эфира уксусной кислоты с целью разложения образовавшейся гидроокиси натрия, и дополнительно осторожно прибавляют еще 10 мл воды дляразложения избыточного количествагидрида натрия, Затем раствор упаривают на водяной бане при температуре,составляющей максимум 40 С, и давлении 15-20 мбар, Остаток растворяютв 250 мл воды и 100 мл диэтиловогоэфира, водную фазу промывают 100 млдиэтилового эфира, после чего объединенные эфирные растворы промывают4050 мл 5 -ного раствора кислого углекислого натрия. Раствор кислого углекислого натрия и водную фазу объе-.диняют, подкисляют прибавлением 5 н.раствора сернокислого калия до рН 2,а затем два раза экстрагируют этиловым эфиром уксусной кислоты, применяя каждый раз по 150 мл последнегоОбъединенные растворы продукта вэтиловом эфире уксусной кислоты последовательно промывают 100 мл воды,50 мл 10 -ного раствора тиосульфатанатрия, повторно 100 мл воды, сушаторганическую фазу над безводным сер-.нокислым натрием, а затем упариваютна водяной бане при температуре,составляющей максимум 40 С, и давлении 15-20 мбар. Полученный остаток растворяют в 600 мл бензола, растворсмешивают с 12 мл (0,105 моль) циклогексиламина, после чего смесь выдерживают в течение ночи при комнатной температуре, Выделившийся в осадок кристаллический продукт отфильтровывают, два раза промывают бензолом, применяя каждый раз по 200 млпоследнего, и затем сушат в вакуумэксикаторе над парафиновыми стружками,Выход 38,2 г (75%). К. = 0,530,60 (циклогексиламин 0,01-0,05).Т. пл. 160-163 С. Гс"7= +12,1(с = 1, метиловый спирт),Вычислено, : С 68,34; Н 7,71;И 8,25,С Н 2 О .ИСН,И (509,63).Найдено,: С 68,5; Н 7,8;И 8,3.Ы ШИ -трет-Бутилоксикарбонил-И -бензилоксикарбонил-Ь-аргинин-лактам.Стадия Д. Гидрат И -трет-бутилоксикарбонил-И -бензилоксикарбонил-Ьаргинина,65,8 г (0,2 моль) гидрата хлоргидрата трет-бутилоксикарбонил-Ь-аргинина растворяют в 100 мл 4 н.раствора. гидроокиси натрия, приготовленный раствор охлаждают до 510 С, затем при перемешивании егосмешивают с 80 мл (0,5 моль) бензилоксикарбонилхлорида и с 150 мл 4 н.раствора гидроокиси натрия так, чтобы значение рН раствора было выше12. Непосредственно после этого ре"акционную смесь дополнительно перемешивают в течение 3-4 ч, затем разбавляют ее прибавлением 150 мл воды,после чего производят экстрагирование 100 мл диэтилового эфира. Образовывалось три фазы. Две нижние фазыеще два раза промывают диэтиловымэфиром, применяя каждый раз по100 мл последнего, смешивают с 300400 мл метилового спирта для того,чтобы гомогенизировать фазы, послечего значение рН раствора, если необходимо, доводят до 12 (прибавлением 4 н. раствора гидроокиси натрия) . Раствор выдерживают в течение6-8 ч, а затем его два раза экстрагируют смесью диэтилового эфира уксусной кислоты и петролейного эфира, взятых в соотношении 1:1, значение рН прибавлением ледяной уксусной кислоты доводят до 6-7 (приблизительно 50 мл), три раза производятэкстрагирование хлористым метиленом, применяя каждый раз по 140 мл последнего, Растворы продукта в хлористом метилене объединяют, два раза промывают водой, применяя каждый раз по 60 мл последней, а затем упаривают на водяной бане при 40 С и давлении 25-30 мбар, Полученный остаток смешивают с 300 мл бензола и,600 мл воды, смесь в течение 2-3 ч перемешивают при 20 С, затем выдерживают в течение ночи при 10 С. Выделившийся в осадок кристаллический продукт отфильтровывают, промывают последовательно 300 мл воды и 300 мл бензола, после чего сушат в вакуум-эксикаторе над пятиокисью фосфора и дарафиновыми стружками.Выход 60 г (703), Т. пл, 122- 124 С, ГсЭ= -20,7 (с. = 1, пиридин).Вычислено, 7.: С 53,51; Н 7,09; И 13,14.СНОНд НО (426,46)25Найдено, 7.: С 53,35; Н 7,2; И 13,1. 20 Стадия Е.Ыф-трет-Бутилоксикарбонил-Ф-бензилоксикарбонил-Ь-аргинин-.30 лактам.59,7 г (0,14 моль) гидрата Б - -трет-бутилоксикарбонил-И-бензилоксикарбонил-Ь-аргинина .(пример 1, . стадия Д) и 19,6 г (0,14 моль) триэтиламина растворяют в 200 мл тетрагидрофурана. Приготовленный раствор охлаждают до -10 С, после чего при укаэанной температуре и при перемешивании его смешивают сначала с 18,5 мл (0,14 моль) изобутилокси 40 карбонилхлорида, а затем через 1 О мин с: 19, б мл (О, 14 моль) три,этиламина. Реакционную смесь перемешивают в течение 1 ч при 0 С и еще в течение 1 ч без охлаждения, причем после завершения перемешивания смесь выливают в 1 л ледяной воды. Выделившийся в осадок кристаллический продуктотфильтровывают, два.раза промывают его ледяной во дой, применяя каждый раз по 100 мл последней, и непосредственно после этого растворяют в 280 мл хлороформа. Хлороформный раствор промывают 100 мл ледяной воды, сушат над без водным кальцием и при температуре максимум 40 С и давлении 20-25 мбар упаривают на водяной бане. Кристал-,лический остаток суспендируют в 70 мл петролейного эфира, продукт отфильтровывают, два раза промывают петролейным эфиром, применяя каждый раз по 30 мл последнего, и сушат в вакуум-эксикаторе над пятиокисью фосфора.Выход 44 г (817). Т пл. 164- 166 С. в 3 в = -24 (с = 1, тетрагидрофуран).Вычислено, Е: С 58,44; Н 6,71; И 14,45.С,9 Н ОИф (390,43)Найдено, 7: С 58,7; Н 6,8; Я, 14,1.П р и м е р 2. Сульфат Н-этил- -Р-фенилаланин-Ь-пролил-Ь-аргининальдегида.Стадия 1. И-Бензилоксикарбонил(о -И-этил-Р-фенилаланин-Ь-пролил-Б - -бензилоксикарбонил-Ь-аргинин-лактам.2,1 г (0,005 моль) М-бензилоксикарбонил-И-этил-Р-фенилаланин-Ь-про лина и 2,15 г (0,0055 моль) М -трете .-бутилоксикарбонил-Ю -бензилоксикарбонил-Ь-аргинин-лактама (пример 1, стадия Е) вводят во взаимодействие или в реакцию конденсации (по способу, описанному в примере 1, стадия 1), при применении пропорциональных количеств реагента и растворителей. При обработке реакционной смеси и во время хроматографии на колонке фракции исследуют с помощью хроматографии в тонком слое при при-. менении в качестве элюирующего средства смеси бензола и толуола (8:2) . Фракции, которые содержат чистый основной продукт (К= 0,4-0,5), объединяют, упаривают на водяной бане . при температуре 40 С и давлении 15- 20 мбар, остаток обрабатывают диизо- пропиловым эфиром, отфильтровывают, промывают диизопропиловым эфиром и сушат в вакуум-эксикаторе над серной кислотой и парафиновыми стружками.Выход 1,9 г (547). В. = 0,75- 0,85.Стадия 2, И-БензилоксикарбонилБ-этил-Р-фенилаланин-Ь-пролил-Н --бензилоксикарбонил-Ь-аргининальдегид..1,4 г (0,02 моль) Ы-бензилокси- карбонил-И-этил-Р-фенилаланин-Ь-пролил-М -бензилоксикарбонил-Ь-аргининЫлактама (пример 2, стадия 1) вводят во взаимодействие аналогично приме 1384203 12ру 1, стадия 2, при применении пропорциональных количеств реагентов.Выход 1,15 г (72 ) продукта, который в соответствии,с данными элементного анализа содержит 1 мольциклогексана. К = 0,55-0,65.зВычислено,: С 67,49; Н 7,47;М 10,73.СуНОМ СНи(782,95)Найдено,; С 67,6; Н 7,5;М 10,5.Стадия 3. Сульфат М-этил-фенилаланин-Ь-пролил-Ь-аргининальдегида.0,78 г (0001 моль) М-бензилоксикарбонил-М-этил-П-фенилаланин-Ь-пролил-М -бензилоксикарбонил-Ь-аргининальдегида (пример 2, стадия 2) вводят во взаимодействие аналогичнопримеру 1, стадия 3, при применениипропорциональных количеств реагентов и растворителей,Выход 0,75 г (70 ) . К = 0,4-0,5.Вычислено, %: С 45,93; Н 7,48,М 14,61; Б 4,64.СНЗОМ 5/6 (НБО) 3,5 (Нф)(575,27) .Найдено,: С 46,1; Н 7,6;М 14,2;. Я 4,6.Исходное соединение, а именноМ-бензилоксикарбонил-М-этил-фенилаланин-Ь-пролин, может быть полученоследующим образом,Стадия А, М-этил-П-фенилаланин.8,25 г (0,05 моль) Р-фенилаланина растворяют в 100 мл 20 .-ного водного этилового спирта. Приготовленный раствор смешивают с 5,65 мл(0,1 моль) уксусного альдегида и2 г 1 О -ного палладия на угле, примененного в качестве катализатора,после чего в течение 2 дн. производят гидрирование. Затем катализаторотфильтровывают, промывают его 60.мл2 н, раствора соляной кислоты, после чего рН водного раствора доводятдо значения 7 посредством прибавле.ния 4 н. раствора гидроокиси натрия.Выделившийся в осадок продукт отФильтровывают, три раза промывают,водой, применяя каждый раз по 20 млпоследней, и сушат в вакуум-эксикаторе над безводным хлористым кальцием еВыход 4,85 г (50%). о 3,= -53(с = 1, 0,1 н. раствор гидроокисинатрия),Вычислено, %: С 68,37; Н 7,82;М 7,25. С Н уОуМ (193,24)Найдено,: С 68,5; Н 7,65;М 7,2,Стадия В. М-Бензилоксикарбонил-М-этил-П-фенилаланин.2,9 г (0,015 моль) М-этил-В-фенилаланина (пример 2, стадия А) растворяют в 22,5 мл 2 н. раствора гидроокиси натрия. Приготовленный раствор смешивают сначала с 1 О мл диоксана, а затем после охлаждения до5-10 С с 2,5 мл (приблизительно0,017 моль) бензилоксикарбонилхлори 15 да, после чего реакционную смесь перемешивают при охлаждении в течение3 ч. После этого реакционную смесьразбавляют прибавлением 40 мл воды,а затем производят экстрагирование20 30 мл смеси, состоящей из диэтилового эфира и петролейного эфира в соотношении 1:1. В результате получают трехфазную систему. Две нижниеФазы вновь экстрагируют 300 мл ди 25 этилового эфира, и объединенные водные фазы подкисляют 1 н. растворомсерной кислоты (рН 2), Выделившийся в осадок продукт три раза экстрагируют этиловым эфиром уксусной кислоты, применяя каждый раз по 30 млпоследнего. Растворы продукта в этиловом эфире уксусной кислоты объединяют, два раза промывают водой, которую каждый раз берут в количестве20 мл, сушат над безводным сернокислым натрием и упаривают затем наводяной бане при температуре, составляющей максимум 40 С, и давлении15-20 мбарВыход 2,7 г (55%) маслообразногопродукта К р = 0,5-0,6Стадия С. М-бензилоксикарбонил-М-этил-П-фенилаланин-Ь-пролин.2,6 г (0,008 моль) М-бензилокси 45(0,008 моль) 2,4,5-трихлорфенола и1,65 г (0,008 моль) дициклогексилкарбодиимида, после чего реакционную смесь выдерживают в течение 4 чпри комнатной температуре. Затем ре-.акционную смесь Фильтруют и фильтрат упаривают на водяной бане приотемпературе максимум 40 С и давлении 15-20 мбар. Полученный остатокрастворяют в 40 мл бензола, раствор промывают два раза 5 -ным растворам30 кислого углекислого натрия, применяя каждый раз по 20 мл этого раствора, и два раза водой, которую каждый раз берут в количестве 20 мл. Непосредственно после этого раствор сушат5 над сернокислым натрием и затем упаривают на водяной бане при температуре максимум 40 С и давлении 15- 20 мбар, Маслообразный остаток растворяют в 10 мп пиридина, раствор смешивают сначала с 0,92 г (0,008 моль) Ь-пролина, затем с 1,12 мд (0,008 моль) триэтиламина, после чего реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре до полного растворения Ь-пролина. Раст"вор выдерживают в течение 4-5 ч и непосредственно после этого упаривают на водяной бане при температуре максимум 40 С и давлении 15- 20 мбар. Полученный остаток растворяют в 25 мл воды и 10 мл диэтилового эфира, водную Фазу двараза промывают диэтиловым эфиром, применяя каждый раз по .10 мл последнего, а. объединенные эфирные растворы два раза промывают 5 -ным раствором кислого углекислого натрия, причем каждый раз применяют по 10 мл этого раствора. Объединенные водные фазы подкисляют до рН 2 посредством прибавления 3 н. раствора соляной кислоты. Выделившийся в осадок продукт три раза экстрагируют бензолом, применяя каждый раз по 15 мл по педне .го, объединенные бензольные экстракты трижды промывают водой, которую всякий раз берут в количестве 5 мл, сушат над безводным сернокислым натрием и затем упаривают на водяной40 бане при 40 С и давлении 15-20 мбар.Выход 2,2 г (64 ) маслообразного продукта. К= 0,5-0,6,.П р и м е р 3. Сульфат И-изобутил-фенилаланин-Ь-пролил-Ь-арги 45 нинальдегида.Стадия 1. Н-Бензилоксикарбонил- -Б-изобутил-П-фенилаланин-Ь-пролил- -Ы -бензилоксикарбонил-Ь-аргининлактам.502,26 г (0,005 моль) Ы-бензилок- сикарбонил-Н-изобутил-П-Фенилаланин-Ь-пролина и Н "трет-бутил-оксикарбонил-Н -бензилоксикарбонил-Ь-аргинин-лактама (пример 1, стадия Е) 55 вводят во взаимодействие или в реакцию конденсации аналогично примеру 1, при применении пропорциональных количеств реагентов и растворителей,При обработке реакционной смеси и впроцессе хроматографии на колонкефракции исследуют с помощью хроматографии в тонком слое в смеси растворителей, состоящей из этиловогоэфира уксусной кислоты, пиридина,уксусной кислоты и воды 480:20:6:11,и Фракции, которые содержат чистыйпродукт с К = 0;75-0,85, объединяют. Затем эти фракции упаривают наоводяной бане при 40 С и при давлении 15-20 мбар, полученный остатокобрабатывают петролейным эфиром, отФильтровывают, .продукт промываютпетролейным эфиром и сушат в вакуумэксикаторе над парафиновыми стружками.Выход 2,7 г (75%). К =0,75-0,85.= -5,8 (с = 1, тетрагидрофуран) .Вычислено, %: С 66,30; Н 6,95;Б 10,87.С оН 80 И, 2/3 (С АННО) ( 72,90)Найдено, %: С 65,0; Н 6,8;М 10,80.Стадия 2. И-бензилоксикарбонил-И-изобутил-В-Фенилаланин-Ь-пролил-И -бензилоксикарбонил-Ь-аргининальдегид.1,45 г (0,002 моль) И-бензилоксикарбонил-И"изобутил"Р-Фенилаланин-Ь-пролил-Н -бензилоксикарбонил-Ь"аргинин"лактама (пример 3, стадия 1)восстанавливают аналогично примеру1, стадия 2, при применении пропорциональных количеств реагентов ирастворителей,Выход 1,0 г (62 ), К- = 0,24.ао оСо 3= +2,3 (с =,1, тетрагидрофуран).Вычислено,.: С 66,64; Н 7,14;Ы 11,24.С 4 о Н гоОИ а /4 (С Н) (747,89)Найдено,: С 66,3; Н 7,1;М 11,2. Стадия 3. Сульфат И-изобутил- "Фенилаланин-Ь-пролил-Ь"аргининаль-дегида.0,81 г (0,001 моль) Н-бензилокси-, карбонил-М-изобутил)"Фенилаланин-Ь-пролил-И -бензилоксикарбонил-ЬЮаргининальдегида (пример 3, стадия 2) вводят во взаимодействие аналогично примеру 1, стадия 3, при применении пропорциональных количеств реагентов и растворителей.Выход 0,45 г (80 ), К р0,64.(628,74)Найдено, %: С 45,8; Н 7,25Н 13,4; Б 4,9.Исходное соединение, а именноИ-бензилоксикарбонил-И-изобутил-Р-фенилаланин-Ь-пролин, может бытьполучено следующим образом,Стадия А. И-Иэобутил-Э-фенилаланин.В качестве исходного веществаприменяют 8,25 г (0,05 моль) Р-фе"нилаланина и осуществляют способаналогично примеру 2, стадия А, стем отличием, что вместо уксусногоальдегида применяют 9,1 мл (0,1 моль)изомасляного альдегида20Выход 8,7 г (70%), Г 3 в = -29,9(с = 1, 0,1 н. раствор гидроокисинатрия).Вычислено, %: С 67,79; Н 8,75;М 6,08. . 25С НОИ 1/2 (НО) (230,30)Найдено, %: С 67,2; Н 8,9;И 6,15.Стадия В, И"Бензилоксикарбонил-И-изобутил-П-фенилаланин.13,32 г (0,015 моль) И-изобутил-Э-фенилаланина (пример 3, стадия А)вводят во взаимодействие аналогичнопримеру 2, стадия В,Выход 3,2 г (60%) маслообразногопродукта, К-- 0,6-0,7,Стадия С. И-Бензилоксикарбонил-Н-изобутил-Р-фенилаланин-Ь-пролин.2,85 г (0,008 моль) И-бензилоксикарбонил-Н-иэобутил-фенилаланина40(пример 3, стадия В) вводят во взаимодействие аналогично примеру 2,стадия С;Выход 2,45 г (67%) маслообразного продукта, К = 0,65-0,70.Проводят биологические испытанияпроизводных пептидил-аргининальдегидов, полученных в условиях предлагаемого способа.При проведении специальных исследований пептиды растворяют в воде(рН 6,0) в концентрациях 10 мг/смпосле чего растворы хранят при 40 С,В течение 5 дн. наблюдают за изменением антитромбиновой активностирастворенного вещества. Характеризующее активность значение определя"ют в системе, которая состояла иэследующих составных частей, см 0,5%-ный фибриноген крупного рогатого скота в 0,9%-ном растворе поваренной соли 0,2; буферный раствор, содержащий трис-(оксиметил)-аминометан и хлористый водород (значение рН 7,2), который также содержит раствор исследуемого пептида, 0,3;5 ед./см раствора Ь 1 Б Бгапйагс 1 Нцшап ТЬгошЬп (И 1 Н, Бетезда, Мэриленд, США), 0,1.Время свертывания этой системы без добавки пептида составляло в приборе БсЬп 1 гпег 6 гоэз Соаяи 1 ошеЕег 15 с.Начальную тормозящую свертывание крови активность отдельных сульфатов трипептид-альдегидов обозначают такой молярной концентрацией, которая в сравнении с контрольным опытом вызывает пятикратное удлинение времени свертывания (1 ;значение),Измеренные на первые, третьи и пятые сутки антитромбиновой активности отдельных пептидов в водном растворе при рН 6,0 и 40 С от начальной активности (нулевые сутки) и приведены в табл. 1.В течение периода наблюдения на" чальная активность сульфата Р-фенилаланин-Ь-пролил-. Ь-аргининальдегида уменьшается в два раза, в то время как И-метильное производное сохраняет свою первоначальную активность, а активность И-этильного и М-иэобутильного соединений уменьшается лишь на 15-20%, В условиях проведения опытов следует считаться с частичной рецемизацией находящегося на конце молекулы Ь-аргининальдегида. Именно этим может быть объяснено незначительное падение активности И-этильного или И-изобутильного про изводного,Действие И-алкилтрипептидальдегидов на плазминфибриновую реакцию также исследуют и определяют на примере сульфата М"метил"П-фенилаланин-Ь-пролил-Ь-аргининальдегида в следующей системе, см : 0,05%-ный фибриноген крупного рогатого скота в 0,9%-ном растворе поваренной соли 0,2; содержащего трис-(оксиметил)- аминометан и хлористый водород буферного раствора (значение рН 7,2) который также содержит исследуемый пептид 0,1; раствор УБ Бгапйагй Нцшап ТЬгошЬп (11 Н) Бетеэда, Мэриленд, США/ 1 О ед./см 0,1; 0,1 ед.