Способ получения пептидов

.8014 зз 415 7/06//А 61 К 37/02 п 4 С Й КОМИТЕТ СССР РЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИИОСУУАРСТНЕН ПО ДЕЛАМ ИЗ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ сихиро(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДОВ(57) Изобретение касается пептидов,в частности способа получения пептидов общей формулы: К,К -Ь-Туг-А-С 1 уВ-С-П-Е-Р, где К = К = Н или К 1 ФФ К,; Н и С-С-алкил, А 61 у; 0-Суасвязанный с С, если С = Суз; ВРЬеили (п-БО, )РЬе; С =;Ьец, Мег(0), Суэсвязанный с А, если А = Э-Суе; ЭАге СН Агя Ьуз ЕАга СНэ Агя; Р = ИН , О-Ьец-Х (при Х ОН, ИН, ОСН, ИНС Н ) или 0-Ьец-Аг 8-Х . (при Х = НН ИНС Н ), обладающих анальгетической активностью, что может быть использовано в медицине. Цель - создание новых более активных веществ указанного класса, Синтез ведут фрагментарной конденсацией мето,дом постепенного наращивания пептидной цепи, исходя из ВОС защищенной С - конечной аминокислоты, с использованием для активации карбоксильных групп карбодиимидного метода и метода смешанных ангидридов. В случае необходимости от полученного защищенного пептида отщепляют имеющиеся защитные группы. Новые пептиды обладают анальгетической активностью при эффективной дозе ЕД = 0,22-4,5 мг/кг (внутривенно) и 0,32-1,5 мг/кг (подкожно), против )25 мг/кг для динорфина, при токсичности Ы о20 - 100 мг/кг, 6 табл.1433415 8 17 Таблица 5 Испытуемое соединение по при- меру Метод семенного канала кролика ИК (наномоль) Таблица 6 10Испытуемое соединение по примеру 3 ф 5 0,04 100 1,0 6,03 20 0,44 Таким образом, соединения, полу ченные в условиях предлагаемого способа, могут быть отнесены к категории среднетоксичных и обладают более высокой анальгетической активностью, чем динорфин. 6,2 2,80,08 10 13 2,0 26 6,5 30 Динорфин А (1-17)М 17,4 Из табл. 5 очевидно, что соединения предлагаемого способа проявляют весьма большую активность по сравне нию с динорфином А, Кроме того, они имеют высдкие активности при ингибировании сокращения илеальных продольных мьппц морской свинки и семенных каналов мьппи, вызванного электричес ким стимулированием.Пептидные соединения, полученные в условиях предлагаемого способа, обладают опиоидными активностями, аналогичными активности динорфина, при чем их действие является весьма сильным, проявляются значительные обезболивающие эффекты при внутривенной инъекции или подкожной инъекции,Очень ценно, что соединения, полученные по предлагаемому способу про. являют сильное обезболивающее действие при систематическом введении по" средством внутривенной или подкожной инъекции, в то время как динорфин и 55 его производные обладают едва заметным обезболивающим действием при внуРезультаты представлены в табл.в единицах. концентрации 507.-ного ингибирования (ЙКд),тривенной инъекции, поскольку этисоединения нестабильны в крови,Соотношение между токсичностью(минимальная летальная доза) пептид"ных соединений, полученных в примерах1 и 2, и эффективной. дозой показанов табл. 6. Ущемление Минимальнаяхвоста летальнаяЕД о,мг/кг доза, мг/кг Формула изобретения Способ получения пептидов общейформулыЕ 1.Х ТуР -А у -В - С - В -Е -ГВгде К К - водород или один изК, и К - водород,другой С,-С-алкил;А - С 1 у 0-Суп, связанныйс С, если С - Суз;В - РЬе, (и-ХОп)РЬе;С - Ьец, Мей(0), Суз, связанный с А, если А -Р Суз;0 - Аг 8, СН Аг 8, Ьуз;Е - Аг 8, СНАг 8;Р - ИН, Р - Ьеи-Х, где Х -ОН, МНп, ОС Н, ИНС Нили Р-Ьеы-АгВ-Х, гдеХ-ннп, ЫНС Н,о т л ич а ю щ и й с я тем, чтоосуществляют постепенное наращиваниепептидной цепи, исходя иэ ИОС защищенной С - конечной аминокислоты, сиспользованием для активации карбоксильных групп карбодиимидного метода и метода смешанных ангидридов иот полученного защищенного пептида,в случае необходимости, отшепляют,имеющиеся защитные группы.Изобретение относится к способу получения пептидов - новых биологически активных соединений, которые могут найти применение в медицине,Цель изобретения - получение новых пептидов, обладающих более высокой анальгетической активностью.П р и м е р 1. Синтез СН-Тир,Гли-Гли-Фен-Лей-Арг-СН Арг-Д-ЛейзМНС НА. Растворяют в 200 мп тетрагидрофурана 25 г БОК-В-Лей-ОН Н О.Растовор охлаждают до -20 С и добавляют в него 11 мп М-метилморфолина и ;9,56 мл этилового эфира хлоругольной кислоты. Через 5 мин добавляют в раствор 12,9 г 70 -ного водного раствора этиламина и смесь перемеЭо шивают приблизительно при -5 С в течение 2 ч. После концентрирования остаток растворяют в этилацетате и промывают водным раствором гидрокарбоната натрия и водой последовательно, После концентрирования досуха получают 24,5 г БОК-Д-Лей-МНС НТ.пл. 103- 106 С.Тонкослойная хроматография (ТХС): значение Кй 0 77 (этилацетат). Опти. -йо ческое вращение: (а) = +20,0 (С=1, ,метанол).Вычислено,: С 60,44; Н 10,14; М 10,84.СНМго,.Найдено,: С 60,42; Н 10,33; М 10,86.Б, Синтез Е-СН Арг(Тос)-Д-Лей 8 НС,Н,.Растворяют в 15 мл тетрагидрофурана 1,43 г Е-СНАрг(Тос)-ОН, (а)-15 о, С=1, диметилформамид, синтезированного из Н-Арг(Тос)-ОН. После охлаждения до -30 С в раствор добаволяют 0,33 мл М-метилморфолина и 0,29 мп этилового эфира хлоругольной кислоты. Через 5 мин в смесь до,бавляют раствор 817 мг СР СООН,Н-Д-Лей-МНСН (синтезирован обработкой БОК-Д-Лей-МНС Н трифторуксусной кисг 5лотой в присутствии анизола) и 0,83 мл триэтиламина в 7 мл тетрагидрофурана, и смесь перемешивают приблизительно при -5 С в течение 2 ч, После конценотрирования остаток растворяют в этилацетате, промывают. водным раствором гидрокарбоната натрия и водой. последовательно и концентрируют досуха, получая 1,58 г стеклообразного Е-СНАрг.(Тос)-Д-Лей-МНС Н. ТСХ: значение КГ 0,68 (метанол//хлороформ = 1/7),Вычислено, %;. С 58,42; Н 7,19;М 13,63.С, Н 44 М,О,БНайдено: С 58, 29; Н 7, 19;М 13,40,В. Синтез БОК-Арг(Тос)-СН Арг(Тос)- 510 Л Леи МНСгН,Растворяют в 4 мл диметилформамида 1,1 г Н Арг(Тос)-Д-Лей-МНС Нполученного каталитическим восстановлением Е-,СНэАрг(Тос)-Д-Лей-МНС Н в15 присутствии катализатора Рй/С, 983 мг,БОК-Арг(Тос)-ОН и 372 мг М-гидроксибензотриазола, В этот раствор приохлаждении льдом добавляют 520 мгдициклогексилкарбодиимида, и смесь20 перемешивают в холодильнике в течение суток и затем при комнатной температуре в течение суток. Полученныетаким образом осадки отфильтровывают,а Фильтрат концентрируют, Концентри 25 рованный остаток очищают с помощьюхроматографии на колонке с силикагелем (элюент: смесь метанол/СНС 1 з1/ 15), чтобы получить 1,2 г стеклообразного продукта БОК в А(Тос)-СНз 30 -Арг(Тос)-Д-Лей-МНС Н.ТСХ: КЙ 064 (метанол/хлороформ =1/7). Оптическое вращение:.(а)= -20,6 (С=1, метанол),Вычислено,: С 52,72; Н 7,30;35 М 1537С 4 оН 64 М ц 04 Бг НгОНайдено,: С 52,82; Н 7,22;М 15,06.Г. Синтез БОК-Лей-Арг(Тос)-СНАрг40 (Тос)-Д-Лей-МНСгН.Растворяют в 12 мл диметилформамида 1,645 г БОК-Лей ОННгО. Растворохлаждают до -20 С и добавляют в негоо0,726 мл М-метилморфолина и 0,631 млэтилового эфира хлоругольной кислоты.Через 5 мин к раствору добавляютраствор 4,986 г СР СООН,Н-Арг(Тос)- -СНАрг(Тос)-Д-Лей-МНСгН, синтезированного путем обработки БОК-Арг50(Тос)-СН Арг(Тос)-Д-Лей-МНС Н триЭ г 5Фторуксусной кислотой в присутствиианизола, и 0,726 мл М-метилморфолинав 12 мл диметилформамида, и смесьоперемешивают приблизительно при -5 С55в течение 2 чПосле концентрированияи последующего отвердевания с помощьюсмеси метанол/эфир получают 5,283 гБОК-Лей-Арг(Тос)-СН Арг(Тос)-Д-ЛейоТСХ: М 0,66 (метанол/хлороформ =1/7). Оптическое вращение: (а)ой25,8 (С=1, метанол).Вычислено, 7.: С 54,36; Н 7,67; И 14,84.С 4 б Н.ИО о Бг СКЛОННайдено, Х: С 54,49; Н 7,63; И 14,62.Д. Синтез БОК-Фен-Лей-Арг(Тос)- -СНАрг(Тос)-Д-Лей-ИНСНРастворяют в 12 мл диметилформамида 1,465 г БОК-Фен-ОН. Раствор охолаждают до -30 С и добавляют в него 0,608 мл И-метилморфолина и 0,528 мл этилового эфира хлоругольной кислоты. Через 5 мин в раствор добавляют 4,69 1 г СГ СООН.Н-Фен-Лей-Арг(Тос) - -СНАрг(Тос)-Д-Лей-МНС Н, синтезированного обработкой БОК-Фен-Лей-Арг(Тос)-СНАрг(Тбс)-Д-Лей-ИНС И трифторуксусной кислотой в присутствии анизола, и 0,608 мл Я-метилморфолина в 12 мл диметилформамида, и смесь перемешивают приблизительно при -5 С в течение 2 ч. После коноцентрирования остаток растворяют в этилацетате, и раствор промывают водным раствором гидрокарбоната натрия и водой последовательно, После концентрирования с последующим отвердеванием под действием смеси метанол/ /эфир получают 5,072 г БОК-Фен-Лей-Арг(Тос)-СН, Арг(Тос)-Д-Лей-ННС Н Т.пл. 127-132"С (разложение).ТСХ: Кй 0,66 (метанол/хлороформ =1/7). Оптическое вращение: (а)о э = -25,4 (С=1, метанол).Вычислено, 7.; С 56,74; Н 7,48; Ы 14,18.С з Нв 4 И ОЬСНзОННайдено, Ж; С 56,64; Н 7,33; Н 13,86.Е. Синтез БОК-СНзТир(С 1 Бзл)-Гли-Гли-ОН.Растворяют в 150 мл тетрагидрофурана 9,09 г БОК-СН Тир-(С 1 Бзл)ОН, (а) = -49 (С=1, этанол), синтезирован по способу С.Т.Чеунг и 2,53 г К- оксисукцинимида, После охлаждения льдом к раствору добавляют 4,12 г дициклогексилкарбодиимида, и смесь перемешивают в холодильнике в течение ночи. Полученные таким образом белые кристаллы отфильтровывают и к фильтрату добавляют 2,91 г Н-Гли-Гли-ОН и 38 мл водного раствора 1,848 г гидрокарбоната натрия. Смесь перемешивают при комнатной температуре в тече 5 10 15 20 25 30 35 40 45 5 Р ние 2 суток и затем концентрируют.Разбавленный водный раствор лимоннойкислоты и этилацетат добавляют к смеси н отделяют этилацетатный слой,После промывки водой с последующимконцентрированием продукт очищаютхроматографически на колонке с силикагелем элюируемой смесью метанол/=1, метанол).Вычислено, 7: С 55,54; Н 5,99;М 6,94.СН з М 30 С 1 уОБС Н ОСН 5Найдено, Ж: С 55,45; Н 5,81;Я 6,89.Ж, Синтез БОК-СН-Тир(С 1 Бзл)-Гли-Гли-Фен-Лей-Арг(Тос)-СН Арг(Тос)-ДзЛей-МНС НРастворяют в 4 мл дкметилформамида 682 мл БОК-СНзТир(С 1 Бзл)-Гли-Гли-ОН и 195 мг И-гидроксибензотриазола.При охлаждении этого раствора льдомв него добавляют 272 мг дкциклогексилкарбодиимида. После перемешиванияв течение 2 ч в раствор добавляютраствор 1,167 г СР СООН.Н-Фен-Лей-Арг(Тос)-СН Арг(Тос)-Д-Лей-ЮНС Н,синтезированного путем обработкиБОК-Фен-Лей-Арг(Тос) в .СН Арг(Тос)-Д 3-Лей-ИНС Н трифторуксусной кислотойв присутствии анизола, и О, 132 мл Яметилморфолина в 8 мл диметилформамида, и смесь перемешивают в холодильнике в течение ночи. Образовавшийсятаким образом осадок отфильтровывают,и фильтрат концентрируют и очищаютхроматографически на колонке с силикагелем (элюент: метанол/хлороформ =1/20). После отвердевания смесьюметанол/эфир получают 1,391 г БОК-СН Тир-(С 1 Бзл)-Гли-Гли-Фен-Лей 3 йАрг (Тос) -СН Арг (Тос) -Д-Лей-ННС Н .Т.пл. 130-135 С (разложение). ТСХ: значение КГ 0,64 (метанол/ /хлороформ = 1/7), Оптическое вращение: (а) = -35,3 (С=1, метанол),Вычислено, Х: С 55,92; Н 6,77; М 12,70.Ст 6 Н щ К О ЯС 1 СНОН ЯО Найдено, Е: С 55,06; Й 6,49;Н 12 ф,52.40 ТСХ: КГ 0,49 (метанол/хлороформ = 1/7). Оптическое вращение; (а)+13,0 (С=1, метанол),51433413, Синтез СН Тир-Гли-Гли-Фен-Лей-Арг-СН Арг-Д-Лей-МНС НфРастворяют, в 10 мл фтористого водорода в присутствии 0,2 мн анизола5 в герметичном для НР реакционном сосуде при -5 С 220,мг БОК-СНТир (С 1 Бзл)-Гли-Гли-фен-Лей-Арг(Тос) - -СНАрг(Тос)-Д-Лей-МНСН. Раствор перемешивают в течение 1 ч и затем НГ отгоняют из реакционной смеси. остаток промывают эфиром и растворякт в воде. Раствор обрабатывают ионообменной смолой Амберлит 1 РА(уксуснокислый тип) и высушивают вымора" 15ванием, Полученный таким образом еочищенный пептид (120 мг) очищают етодом жидкостной хроматографии выокого разрешения (фаза Нуклеосил С 18, диаметр колонки 2, длина205 см, элюент 0,1% НС 1 в растворе воды: ацетонитрила = 81:91).и затем ушат вымораживанием, чтобы получить О мг СН Тир-Гли-Гли-Фен-Лей-Арг-СН -з Арг-Д-Лей-МНСН . 25ТСХ: значение К 2 0,70 (бутанол/ уксусная кислота/пиридин/вода15/5/5/8).Оптическое вращение; а) -21,8 (С=0,4, 0,01 н. НС 1). асс-спектр (ГАв) : 1036 (И+Н) , Ами- З 0 окислотный анализ: Гли 1,87 (2); ей 1,96 (2); Фен 1,00 (1) Арг 0,95 (1) (пики, соответствующие СНэ Тир- и СНАрг, не обсчитаны). П р и м е р 2. Синтез Тир-Д-Цис 35 1 ли-Фен-Цис-Ар г-СН Ар г-Д-Лей-Ар г-МН .А. Растворяют в 10 мп диметилфорИамида 2 493 г БОК-Д-Лей-ОН Н О. РастЭ вор охлаждают до -20 С и добавляют в него 1,1 мл М-метилморфолина и 0,96 мп этилового эфира хлоругольнои кислоты. Через 5 мин в смесь добавляют раствор 4,414 г СГСООН.Н-Арг(Тос)- "Н и 1,65 мл М-метилморфолина в 20 мл диметилформамида и смесь перемешивао ют приблизительно при -5 С в течениеч. После концентрирования остаток растворяют. в этилацетате и последовательно промывают раствором гидрокарбоната натрия и водой. После концентрирования к остатку добавляют эфир, чтобы вызвать затвердение продукта. Таким образом получают 4,96 г БОК-Д-Лей-Арг(Тос)-МН. Т.пл. 110 -120 С (разложение),5БВычислено, 7.: С 52,73; Н 7,50;М 15,37.СН 40 М 6 ОБ НОНайдено, 7; С 52,77; Н 7,60;М 15,14.Б. Синтез Е-СН Арг(Тос)-Д-Лей 3Арг (Тос) -МН.Растворяют в 30 мп тетрагидрофурана 3336 г Е-СНзЛрг(Тос)-ОН. Раствороохлаждают до -20 С и добавляют в него 0,77 мл М-метилморфолина и 0,67 млэтилового эфира хлоругольной кислоты.Через 5 мин к смеси добавляют раствор3,882 г СР СООН фН-Д-Лей-Арг(Тос)-МНсинтезированного путем обработки БОКД-Лей-Арг(Тос)-МН трифторуксуснойкислотой в присутствии анизола, и1,17 мл триэтиламина в 30 мл тетрагидрофурана, и смесь перемешиваютоприблизительно при -5 С в течение2 ч, После концентрирования с последующим отверждением смесью метанол/-Арг(Тос)-МН в присутствии Рй/С,2,918 г БОК-Арг(Тос)ОН и 1,1 М-гидроксибензотриазола. К этому растворупри охлаждении льдом добавляют 1,543 гдициклогексилкарбодиимида, и смесьперемешивают в холодильнике в течениесуток и затем при комнатной температуре в течение суток. Образовавшийсятаким образом осадок отфильтровываюти фильтрат концентрируют. Остатокочищают хроматографически на колонкес силикагелем (элюент: смесь метанол//хлороформ = 1/15) и отверждают эфиром получая 4,917 г БОК-Арг(Тос) -Вычислено, Х: С 51,32; Н 6,76;К 16,43,С, НК, О Б Н ОНайдено, Х; С 51,15; Н 6,54;К 16,48,Г. Синтез БОК-Цис(СН,Бзл)-Арг(Тос)-СНзАрг(Тос)-Д-Лей-Арг-(Тос)-КН,.Растворяют в 4 мл диметилформамида 747 мг БОК-Цис-(СНзБзл)-ОН. Раст Овор охлаждают до -20 С и в него добавляют 0,254 мл К-метилморфолина и0,221 мл этилового эфира хлоругольной кислоты. Через 5 мин в раствордобавляют раствор 2,497 г СР СООН НАрг(Тос)-СН Арг(Тос)-Д-Лей-Арг(Тос)-КН рр синтезированного путем обработ-ки БОК-Арг-(Тос)-СНзАрг(Тос)-Д-ЛейАрг(Тос)-КН трифторуксусной кислотой в присутствии анизола и 0,277 мл 20К-метилморфолина в 6 мл диметилформамида, и смесь перемешивают в течение2 ч приблизительно при -5 С. Послеконцентрирования смесь растворяют вэтилацетате и затем промывают раствором гидрокарбоната натрия и водойпоследовательно. После дополнительного концентрирования продукт отверждают смесью метанола и эфира, получая2,548 г БОК-Цис(СНБзл)-Арг(Тос)- ЗО-КН , синтезированного путем обработки БОК-Фен-Цис(СНзБзл)-Арг(Тос) -СНАрг(Тос)-Д-Лей-Арг(Тос)-КН трифторуксусной кислотой в присутствиианизола, и 0,211 мл К-метилморфолинав 5 мп диметилформамида, и смесь перемешивают в течение .2 ч при температуре -5 С. После концетрирования ос-,отаток растворяют в этилацетате, ираствор промывают водным растворОмгидрокарбоната натрия и водой последовательно. После дополнительногоконцентрирования продукт отверждаютдобавкой смеси метанола и эфира, получая 2,126 г БОК-Фен-Цис(СН Бзл)Арг(Тос)-СН Арг(Тос)-Д-Лей-Арг(Тоср)- о/хлороформ . 1/). Оптическое вращение: (а)-18,9 (С=1, метанол).Вычислено, Х: С 54,83; Н 6,89;К 13.,91,С т, Н,у(р К,ОЯ5/2 СН зОКНайдено, Х: С 54,62; Н 6,34;К 13,64.Е. Синтез БОК-Д-Цис-(СН Бзл)-ГлизРастворяют в 15 мл диметилформамида 3,233 г БОК-Д-Цис(СНзБзл)-ОН,Раствор охлаждают до -20 С и в него добавляют 1,1 мл К-метилморфолина и0,956 мл этилового эфира хлоругольной кислоты. Через 5 мин к этомураствору добавляют раствор 1,396 гНС 1 Н-Гли-ОС Н и 1,1 мл К-метилморфолина в 20 мл диметилформамгдар исмесь перемешивают в течение 2 ч притемпературе около -5 С, После концентрирования остаток растворяют в этилацетате, и раствор промывают последовательно водным раствором гидрокарбоната натрия и водой. После концентрирования к остатку добавляют н-гексан,чтобы вызвать затвердевание продукта.Таким образом получают 3 6 г БОК-ДоЦис-Гли-ОС Н. Т.пл. 80-82 С.ТСХ: значение М 0,74 (хлороформ/-(СНБзл)-Гли-ОС НРастворяют 2,068 г БОК-Тир(С 1 Бзл)-ОН в 20 мп тетрагидрофурана. Раствороохлаждают до -20 С и добавляют в него0,517 мп К-метилморфолина и 0,45 мtэтилового эфира хлоругольной кислоты.Через 5 мин в этот раствор добавляютраствор 1, 94 г СР СООН Н-Д-Цис (СН Бзл)Гли-ОС Нр синтезированного путемобработки БОК-Д-Цис(СНзБзл)-Гли-ОСЯтрифторуксусной кислотой в присутст 1433415вии анизола, и 1 мл триэтиламина в 20 мл тетрагидрофурана, и смесь перемешивают в течение 2 ч при температуо ре около -5 С. После концентрирования 5 к остатку добавляют воду, чтобы образовался осадок, который отфильтровывают и растворяют в смеси метанола и ороформа, После концентрирования остатку добавляют эфир, цтобы выз- О ать затвердевание продукта. Таким бразом получают 2,661 г БОК"Тир С 1 Бзл)-Д-Цис(СН Бзл)-Гли-ОС Н.,пл. 149-150 С, )ТСХ: значение КГ 0,63 (хлороформ/ 15 этилацетат = 2/1). Оптическое вращеие: (а) = +17,0 (С=1, диметилфор-, амид).Вычислено, %: С 59.,01; Н 591; 5,73. 2 О С 36 Н 43 нэо, С 12Найдено, %; С 58,94; Н 5,75; 5,62.3. Синтез БОК-Тир(С 1 Бзл)-Д- с (СНэ Бзл) -Гли-ОН, 25Растворяют в 30 мл тетрагидрофураа 2,345 г БОК-Тир(С 1 Бзл)-Д-Цис СН Бзл)-Гли-ОС Н и затем добавляютЭраствор 3,2 мп 1 н, раствора гидроксида натрия, Смесь перемешивают при ЗО комнатной температуре в течение 1 ч Й добавляют к ней 3,2 мп 1 н. соляной Кислоты. Полученную смесь концентри.руют. К остатку добавляют воду, чтобы продукт отвердел. Таким образом получают 1,899 г БОК-Тир(С 1 Бзл)-ДЦис(СН Бзл)-Гли-ОН. Т.пл. 133-138 С (разложение).ТСХ; значение М 0,25 (метанол/ /хлороформ = 1/7), Оптическое вращение: (а) = +35,8 (С=1, метанол).Выимено, %: С 57,95; Н 5,58; Н 5,96.С 4 Н ЗИОт енС 1 а Найдено, %: С 57,81; Н 5,33;45 Ы 5,92.И. Синтез БОК-Тир(С 1 Бзл)-Д-Цис (СНБзл)-Гли-Фен-Цис(СН Бзл)-Арг(Тос)- СН Арг(Тос)-Д-Лей-Арг(Тос)-ИН 3Растворяют 983 мг БОК-Тир(С 1 Бзл)- 5 Д-Цис(СН Бзл)-Гли-ОН и 226 мг Ы-гид 3 роксибензотриазола в 5 мл диметилформамида. При охлаждении льдом в раствор добавляют 316 мг дициклогексилкарбодиимица, После перемешивания в течение 2 ч в этот раствор добавляют раствор 1,94 г СРСООНаН-.Фен-Цис3(СН Бзл) -Арг (Тос) -СН Арг (Тос) -Д-ЛейАрг(Тос)-ХН, синтезированного путем,обработки БОК-Фен-Цис(СНБзл)-Арг (Тас)-Д-Лей-Арг(Тос)-ЫН трифторуксусной кислотой в присутствии анизола, и 0,167 мл И-метилморфолина в 10 мл диметилформамида, и смесь перемешивают в холодильнике в течение ночи. Полученный таким образом осадокфильтруют. После хроматографической очистки на колонке с силикагелем (элюируемой смесью метанол/хлороФорм = 1/20) с последующим отвержцением смесью метанол/эфир получают 20 г БОК-Тир(С 1 Бзл)-Д-Цис(СНи Бзл) - Гли-Фен-Цис(СНзБзл)-Арг(Тос)-СИАрг (Тос)-Д-Лей-Арг(Тос)-ЫН . Т.пл, 123- 130 С (разложение).ТСХ: значение КГ 0,63 (метанол/ /хлороформ = 1/7). Оптическое враще-. ние: (а) = -17,5 (С=1, диметилформамид).Вычислено, %; С 56,60; Н 6,52; М 1189.С Н И,р 0 р ЯС 1 С Н ОСНИЗ/2 СННайдено, %: С 56,38; Н 6,18; И 1172,К, Синтез Тир-Д-Цис-Гли-Фен-ЦисАрг-СНр 1 дарг-Д-Лей-Арг-ЫНРастворяют 515 мг БОК-Тир(С 1 Бзл) - -Д-Цис (СНз Бэл) -Гли-Фен-Цис (СН Бзл) - Арг (Тос) -СН Арг (Тос) -Д-Лей-Арг (Тос) - -ИН в 20 млфтористоводородной кислоты ь присутствии 5 мл анизола при -5 С в реакционном сосуде,герметичномдля фто" ристого водорода (НР).Раствор перемешивают втечение 2 ч,и затемотгоняют НР водорода (НР). Раствор перемешивают в течение 2 ч, и затем отгоняют НР из реакционной системы. Остаток промывают эфиром и растворяют в воде. Раствор обрабатывают смолой Амберлит 1 РА(уксусно-кислый тип) и затем сушат вымораживанием. Растворяют 320 мг высушенного продукта в 13 л воды и раствор подщелачивают до рН 8 водным аммиаком, Затем в раствор вводят воздух при перемешивании в течение 2 суток, и смесь подкисляют до рН б и, затем сушат вымораживанием. Полученный таким образом неочищенный пептид очищают методом жидкостной хроматографии высокого разрешения (фаза Нуклеосил 5 С 18, диаметр и длина колонки 2 и 25 см, элюент: 0,05%-ный раствор НС 1 в смеси вода/ /ацетонитрил = 88/12) и сушат вымораГ нинанием, получая нО мг 1 ир-Д-ЦисГпи-Фен-ис-арг-СН Арг-Л-Леи-нрг-рр.16 17 11143ТСХ: значение И 0,56 (бутанол/ /уксусная кислота/пиридин/вода =15/5/5/8). Оптическое вращение: (а), -"29 (С=0,4, 0,01 н. НС 1).Масс-спектр (ГАВ): 1183 (М+Н). Аькнокислотный анализ: Гли 1,02(1); Цис 1,83(2); Лей 1,04,(1); Тир 0,80(1); ;Фен 1,00(1); Арг 2,66(2)", Цис, обусловленный СНАрг, не рассчитывался,П р и м е р ы 3-29. Приведенные в табл. 1 соединения синтезированы аналогичным обычным жидкофазным способом, как в примерах 1 и 2, В этих экспериментах производные динорфина, модифицированные в положениях 1-3 (Тир-Гли-Гли), в положениях 4-7 (ФенЛей-Арг-Арг), в положениях 4-8 (Фен" Лей-Арг-Илей) и в положениях 4-9 3415 2(Фен-Лей-Арг-Арг-Лей-Арг), синтези;рованы стадкйным способом исходя изС-терминальной группы в каждом пептиде. Затем зтн производные в положениях 1-3 и производные в положениях 47, 4-8 или 4-9 конценсиравали совместно по методу дициклогексилкарбодиимидов или методом смешанного ангиди рида, Все защищающие группы удаляютфтористым водородом (НГ), и продукточищают методом препаративной жидкостной хроматографии высокого разрешения, используя носитель обратимой фазы. В примере 13 все защищающие группы удалены НР, а соединение окисленовоздухом н затем очищено методом препаративной жидкостной хроматографиивысокого разрешения.1433415 14 Продолжение табл, 1 Трет-Лей; (СН) ОСН(ЯН )СООН Гомо Арг; И Н С( КН)ЛНСН СН СН СН СН(ЯН )СООН Фен (пара-ЯО);КО )СНСБ ЮНр СООН Сар: СН 1 МНСНСООНВ табл. 2 перечислены соединения, состав);величины угла оптическогополученные в условиях предлагаемого 15 вращения и значения Ы .способа, с указанием аминокислотногс Таблица 2 Аминокислотный анализ ФенАрг Лиз Гли Лей 197 . 103-27 2 -23,0 1,96 2,00 16 2,03 0,52 2,00 1,00 1,00 0,46 П р и и е ч а и и е. В амннокислотном анализе рассчитывают соотношение толькоаминокислот: Гли,Лей, Фен, Арг, Ала, Тир, Лиз, Сер, Циси Глув.") 15/5/5/8. Результаты испытаний на животныхиллюстрируют эффективность соедине" ний в качестве обезболивающих агентов.1433415 1 бПродолжение табл.З 14 0,7 2,0 Т а б л и ц а 4 1,0 0,44 0,8 0,32 13 30 1 ф 5 Испытание 1. Испытание на обезболивание. Испытываемое соединениерастворяют в физиологическом солевомрастворе и вводят его внутривенноили подкожно самцам мышей линии Иду5(вес тела 20-27 г, при изучении обычно разбивают на группы по 8). Обезболивающую активность измеряют в испытании с ущемлением хвоста,В этом испытании ущемление хвостав основании хвоста, включая анальнуюслизистую оболочку, помещают зажим,развивающий давление около 300 г, иизмеряют латентность кусания этогозажима. До эксперимента проводилиотбор животных на ноцицептивностьзажима хвоста, причем исключали изэксперимента тех мышей, которые некусали зажим в пределах 3 с. В качестве критерия обезболивания применяли латентность, превышающую 6 с.Величины ЕД(доза, вызывающая507. обезболивания) рассчитывают пометоду Литчфилда и Уилкоксона, Результаты показаны в табл, 3 (привнутривенной инъекции) и в табл. 4(при подкожной инъекции).Таблица 3 Динорфин (1-13) более 25,0 Испытуемое сое- Ущемление хвостадинение по при- ЕД , мг/кгмеру (подкожно)0,75 0,24 3,4 4,3 3,9 3,3 8 10 2,0 0,8 12 3,0 13 0,22 Испытание 2. Опиоидная активность,Опиоидные активности соединений определяют по предлагаемому способу с ис" пользованием семенного канала кролика. В этом:испытании взрослых самцов кроликов умерщвляют, вводя воздух в ушную вену. Сразу после смерти проводят лапаротомию и удаляют правый и левый семенные каналы. Семя выдавливают из каналов в раствор Ринджера.Каждый канал нарезают на части (2,5 см длиной от конца со стороны предстательной железы), Эти кусочки семенного канала суспендируют .с помощью вин" та в стеклянной ячейке емкостью 6 мл при постоянной температуре и стимулируют электрическим стимулятором, имеющим платиновые электроды при следующих условиях: частота 0,1 Гц, 1 млс и 90 В. Сокращение, вызванное электрическим стимулированием, записывают через преобразователь.Опиоидную активность определяютна основании ингибирования сокращения, вызванного электрическим стиму- лированием