Способ получения антибиотика с-15003 р-4

ОП ИСАНИЕ (П 1882414ИЗОБРЕТЕН ИЯ Союз СоватскизСоциалистическияРеспублик К ПАТЕНТУ(23) Приоритет - (32) 181177 (31) 139384/77 (33) Япония С 12 0 9/14 1 Ьвударстюный квинтет СССР ав доаи яэобретеннй и атнрытяй,973(0 ) Опубликовано 15.11.81, Бюллетень 42 Дата опубликования описания 151 131 1 Ф ид 1 фР.,нг(72) Авторы изобретения Иностранная фирма(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА СРИзобретение относится к микробиологии и касается производства антибиотиков.Предложенный антибиотик новый испособ его получения в патентной инаучно-технической литературе не описан.Целью изобретения является получение антибиотика,Эта цель дости гается тем, что штаммйосагд 1 а зр.йС( АТСС,ЗГО) выращивают в питательнойсреде, содержащей источники углерода и азота, с добавлением лейцинаили его производных,Штамм йосагд 1 а зр, ЙС,продуцирующий антибиотик, был выделениз почвы и других образцов.Штамм МСдепонирован в исследовательском институте ферментации Адепсу о 1 1 пдцзсг 1 а 1 Бс 1 епсе апдТесбпо 1 оду (ГЕЙМ) под номером 3992,в институте фернентации, Осака (1 ГО)под номером 1 ГО 13726 и в американской коллекции разновидностей куль 2тур (АТСС), Мэриленд, США под номером 31281.Культурально-морфологические приз"наки, Вегетативный мицелий растетхорошо, гифы достигают 0,8-1,2 мкм,в диаметре, в некоторых случаях ихможно разделить на фрагменты. Воздушный мицелий накладывается на ве"гетативный мицелий, часто образует 10 монолиты ( 50-200 Х 200-1000 мкм), накоторых продолжается дальнейший ростВоздушный мицелий представляет собойволнообразные, прямые или петлеобразные спирали. Микроскопическое исследование старых культур показываетчто лишь в нескольких случаях в цепях образуются конидии как клетки,тогда как клеточные суспензии, полученные с поверхностей таких культур 20 содержат много удлиненных эллипсо"идальных (0,8-1,2 мкм х 4,8-6,8 мкм)и эллипсоидальных (0,8-1,2 х 1,О.- 2,0 мкм ) телец., похожих на артроспорыСахарозо-нитратный агар : ростумеренный , цвет дыни до янтарно 882414рыжевато-коричневого, образует тела, похожие на монолить. Воздушный мицелий скудный, белый. Растворимый гигмент отсутствует или бледный желтовато-рыжевато-коричневый.Глицерино-нитратный агар : субст. ратный мицелий - рост умеренный, цвета слоновой кости, образует тела похожие на монолиты. Воздушный мицелий умеренный, белого цвета. Растворимый пигмент отсутствует.Глюкозо-аспарагиновый агар : рост умеренный, цвета календулы до яркожелтого, Воздушный мицегий скудный, белого цвета. Растворимый пигмент ярко-желтыйГлицериново-аспарагиновый агар рост умеренный, цвета слоновой кости образует тела, похожие на монолиты.Воздушный мицелий скудный, белый.Растворимый пигмент отсутствует,Крахмальньй агар : рост умереннь й, ц вета светло": слоновой кости до светло-гегцного, образует тела, похожие на моноли п Воздушный мицелий обильный, цвега светлой слонозой ности, Растворимый пигмент от-.су ся/гАгар нв овсяной муке : рост умеренный, вета от светлой слоновойкос ги до колониального желтого, образует тепа, похоже а монолиты.Воздушный мицег 1 ий скудньй, от белогодо светло-желтого, Растворимый пигмент отсутствуег,Тирозиновый агар : рост умерен-ый, от светлой слоновой кости доцвета светло-желтой дыни, образуеттела,. похожие на монолит. Воздушныймицелий умеренный, от белого до цвета светлой слоновой кости, Растворимый пигмент цвета верблюда,физиологические признаки. Температурный интервал ооста 12-38 С,Температурный интервал, в которомнаблюдается хороший воздушный рост,составляет 20-35 С. Желатин разжижает, Крахмал гидролизует, Ни тратывосстанавливает, Молоко пептонизирует, но не коагулирует, Казеин расщепляет, Иеланоидные пигменты наагаре с пептоном и дрожжевым экстрактом не продуцирует, на тирозиновом агаре продуцирует, Тирозин разлагает, Ксантин и гипоксантин не разлагает, Толерантность к.лизоциму положительная. Толерантность к хлористому натрию - 23. Очень хорошо растет на фруктозе, маннозе, хорошо растет на глюкозе, маннитоле, сахарозе, растворимом крахмале,Усваивает ксилозу, арабинозу, галактозу, рамнозу, трегалозу, раффинозу, мелибиозу, слабо усваиваетмальтозу, глицерин, не усваивает-инозитол, О-сорбитол, лактозу,Лейцин в качестве добавки можноприменять в форме производного. Примерами производного являются алкильные сложные эфиры С 1 -С например,метиловый эфир, этиловый эфирлейцина, амиды, такие как амид С -С1 ралкиламиды (например М-метиламид,й. этиламид ) лейцина, его кетокислотынапример -кетоизокапроновая кислота) или их соли например гидрохлоридыЖелательно 0 С -форма лейцина, Применимыми являются также свободнаяформа лейцина и его производные исмесь производных.Количество добавляемого к средевещества составляет 0,01 - 1(вес/объем), предпочтительно 0,1-,0,5, Время добавления любое на протяжении продуцирования антибиотика Р, предпочтительно добавлять в начале стадии культивирования.Среда для культивирования антибиотика может содержать источникиуглерода и азота, неорганическиевещества, следы питательных веществ. В качестве источников углерода используют глюкозу, лактозу, сахарозу, мальтозу, декстин, крахмал, глицерин, маннитол, сорбитол, жиры и масла (например, масло из бобов,сои, свиное сало , куриный жир) .В качестве источников азота используют мясной экстракт, дрожжевой экстракт, сухие дрожжи, соевую муку, жидкость от замоченного зерна, пептон, муку хлопковых семян, мелассу, моче- вину, соли аммония ( например сульфат аммония, хлорид аммония, нитратаммония) и нитрат солей (напримернитрат натрия, нитрат калия),Среда также может содержать солинатрия, калия, кальция, магния; солижелеза, марганца; цинка, кобальта,никеля, соли фосфорной кислоты, бор -ной кислоты. Среда может содержать в качестве добавок витамины ( например 81, В никотиновую кислоту, В 1,С, Е), нуклеиновые кислоты ( например пурин, пирими, дин и их производные) .882414 еТ а б л и,ц а 1 юВыходмкг/мл Соотношениекомпонентов,Ф Количестводобавок,4 Доба вляемоевещество Время добавлс" ния, ч 1 Г РРР10 65 25 10 Без добавки 5 28 67 13,5 0,1(0) в графе "Время добавления" означает, что веществодобавлено в качестве одного из ингредиентов.ч Таблица 2 Добавляемое вещество-. лейцин Для установления нужного значениярН среды добавляют неорганическиеили органические кислоты, щелочи,буферные растворы. В качестве,антивспенивающих веществ добавляютподходящие количества масел, жиров,поверхностно-активных веществ. Культивирование проводят в любых стационарных, со встряхиванием, аэробным погружением и других условиях для выращивания культур. Для получения высоких выходов предпочтительным является аэробное погружение культуры. Инкубирование осуществляют при температуре 20-35 ф С при начальном рН 5,5-8,5, предпочтительным является интервал 23-30 С и рН 6,5-7,5. Определение полученных Р,РиРосуществляют следующим образом. 6Время инкубироаания может быть48-240 ч.Получают антибиотик следующим образом.Штамм НС выращивают в среде 1, содержащей 3 растворимогокрахмала, 0,2 хлористого .аммония,0,05 сульфата магния, 1 093 калийдикислого фосфата, 2,09 дикалий с кислого фосфата, 0,001 сульфата железа и добавочные. вещества, или вкультуральной среде П, содержащей 5 Фдекстрина, 33 жидкости от замачивания,зерна, 0,13 пептона, 0,51 карбоната 1 ь кальция и добавочные вещества, и,затем эту среду культивируют. Результаты, полученные для среды Т,приведены в табл.), а результаты,полученные для среды 1, приведены в гв табл.2. Питательный бульон экстагируютравным объемом этилацетата. Слойрастворителя концентрируют и сушат, затем растворяют этилацетатом для получения 1/100 объема исходного бульона, Продукты определяют тонкослойной хроматографией на силикагеле, используя насышенный водный раствор этилацетатом. Получаемое количество и соотношение компонентов определяют по величине поглощения на длинноволокновом ТСХ-многоточечном измерительном приборе модели С 5-910 на основе интеграл-плотностей каждого пятна на хроматограмме при 254 мм. Отношение компонентов представлено в процентах вес/вес в общих продуктах, Р, Р, Р. Как показано в табл. 1 и 2 штамм ИСпродуцирует антибиотик Рв количестве 65-8 М от общего количества в присутствии специФических добавок, и 253 или меньше в отсутствие таких добавок, Поэтому выделение Риз питательного бупьона является в первом случае болееlэффективным, чем во втором.Так как Р, полученный таким способом в Ферментационной жидкой среде, является липофильным нейтральным веществом, его обычно выделяют из питательного бупьона в соответствии со способами выделения и очистки которые обычно используют для выделения таких микробных метаболитов, Рлегко экстрагируется из питатель. ного фильтра несмешивающимися с водой органическими растворителями, такими как сложные эфиры жирных кислот например этилацетат и амилацетат, спирты, например бутанол, галоидированные углеводороды например хлороФорм, кетоны, например метилизобутилкетон. Экстрагирование Рпроводят при рН, близком к нейтральному, и предпочтительно экстрагируют этилацетатом, рН которого равен 7. Экстракт промывают водой и концентрируют при пониженном давлении. Затем к концентрату добавляют неполярный растворитель, например петролейный эфир или гексан, и выделяют в виде осадкасырой продукт, содержащий активное соединение. Полученный сырой продукт подвергают при желании обычным способам очистки, Так, в качестве2414 8обычного способа очистки может быть использована адсорбционная хроматография, Для этой цели используют один из обычно применяемых адсорбентов,например силикагель, окись алюминия, макропористые неионные смолы, ад сорбенты и т.д . Рв сыром продукте отделяют на таком силикагельном хроматографе, например, с помощью 10 15 20 75 зО 35 40 45 50 петролейного эфира и гексана иэлюирование осуществляют, добавляятакой полярный растворитель, какэтилацетат, ацетон, этанол или метанол, или галоидированный водород,как дихлорметан или хлороформ с добавкой полярного растворителя, такого как спирт, например метанолаили этанола, кетона, например, ацетона или метилэтилкетона, или томуподобных. Таким образом можно элюировать, выделить и получить Р.Если в качестве средств очисткииспользуют адсорбент как макропористую смолу, то элюирование проводятсмесью воды с низшим спиртом, низшим кетоном или сложным эфиром. Например, низшим спиртом может бытьметанол, этанол, пропанол или бутанол, низшим кетоном может быть, например ацетон метилэтилкетон. В качестве сложного эфира может быть этилацетат, бутилацетат. Сырой продуктИ растворяют в 603 смеси метанолвода и адсорбируют на колонке 01 а 1 опНР, Колонку промывают 703 смесьюметанол-вода. Затем осуществляютэлюирование Р903-ной смесью метанол-вода,Фракции, содержащие Р, собирают и концентрируют при повышенномдавлении. К сухому продукту добавляют5-8 объемов этилацетата и полученнуюсмесь оставляют выстаиваться, послечего выделяют кристаллы Р.Выход антибиотика достигает около 653 или более, при этом Р легко выделяется из питательногобульона. Поэтому предлагаемый способ является преимущественным дляпромышленного получения Р. Физико-химические свойства Р приведены в табл,3.Элементарный анализ Элементарный анализ Ультрафиолетовый спектрпоглощения НМ (б ) Инфракрасный спектрпоглощения КВг, см ЯМР-спектр частиц на млн, 100 Мг в СДИ Масс-спектр (в/е)Растворимость Цветовая реакция С Н С 1 й 0 = 649,196177- 180Антибактериологическая активностьПо способу бумажных дисков определяют ингибирующие концентрации штаммавыращенного на триптикинозно-соевом агаре (ВВ 1.), против микроорганизмов, перечисленных далее. Так,диски фильтровальной бумаги, пропитанные каждый 0,02 мл раствора концентрации 300 мкг/мл Р, помещают на пластины, инокулированные соответственно микроорганизмамй, перечисленными ниже, для определения минимальной ингибирующей концентрации. Полученные результаты показали, что антибиотики не обладаютактивностью против следующих микроорганизмов : ЕзсбегсНа со 11, Ргоецз чц 1 цагз, Ргоецз щгаЬ 115,Рзецдощопаз аегцупоза, Бсарйу 1 ососсцзацгецз, Вас 111 цз зцЬ 1115 Вас 11 цзсегецз, К 1 еЬзе 11 а рпецщопае,Беггата щагсезсепз, ИусоЬасйегцщач 1 цщ.С другой стороны, на агаровыхпластинках, содержащих испытываемуюсреду ( 3,5 г динатрийфосфата, 0,5 гмонокалийфосфата, 5 г дрожжевогоэкстракта (О 1 Гсо), 10 г глюкозы,15 г агара, 1000 мл дистиллированной воды, рН 7,0), было определеноингибирование роста Та 1 агощусезаче 11 апецз, В этом опыте минимальная ингибирующая концентрация составляет 1-1,5 мкг/мл для Р, Далеекультивируют в качестве исследуемого организма дикий штамм Тейгайущепа.ругГогщз х на опытной среде, состоящей из 20 г протеоза-пептона (ОГсо)1 г дрожжевого экстракта, 2 г глюкозы1000 мл дистиллированной воды и10 мл 1 М фосфатного буфера рН 7,0при 28 С в течение 44- 48 ч и определяют методом последовательных разбавлений активность ингибированияроста антибиотиков против этого конкретного микроорганизма, Оказалось,что ингибирование роста наблюдаетсяпри концентрации 0,5 мкг/мл дляС Р. Робладает активностью противследующих микроорганизмовРцзсадцщ 1 ечег 1, Не 1 щпТЬозрогцщз 1 уподецщ чаг, ггедц 1 аге,Руг 1 сц 1 аг 1 а огукае, СосЬ 1 оЬогцзщуаЬеапцз, Зс 1 егойпа зс 1 егосогцщ,Ре 11 сц 1 ага заза 11, ТгсйорЬуйопгцЬгцщ, Кподойогц 1 а гцЬга иСгуреососсцз пеоГогщапв.5 то 5 Антиопухолевая активность. Было исследовано терапевтическое действие Рвводимого внутрибрюшинно в течение 9 последовательных дней, против лейкемии Р 388 у мышей ( 1 х 10 клеток/животное, трансплантированных внутрибрюшинно, Результаты показали, что в единицах степени продления продолжительности жизни эти соединения обладают антиопухолевой активностью порядка 2003 при уровне дозы 0,00625 мг/кг в день.Токсичность. В тестовых испытаниях на острую токсичность, проведенных на мышах в качестве подопытных животных, которые предусматривали внутрибрюшинные инъекции Р, все исследованные антибиотики продемонстрировали величину ЛД= 20 я 0,625 мг/кг и ЛД, = 0,313 мг/кгАнтибиотик Робладает высокойингибирующей активностью противгрибковых организмов и простейшых ипоэтому представляет ценность в ка ЧЕСтВе фуНГицидНоГО агента илИ аГента против простейших. Кроме того,так как Рдемонстрирует продлевающее продолжительность жизнидействие у млекопитающих, у которых З 0 есть опухоль ( например мышей ) можнотакже ожидать, что это соединениесможет найти применение в качествеантиопухолевого лекарства.Как фунгицид или агент противпростейших Рможно испольэовать" для оценки бактериальной экологии впочве, активном иле, жидкости животных организмов и т.д. Так, если нужно выделить ценные бактерии из образ цов почвы или если нужно оценитьдействие бактерий независимо от грибковых или простейших организмов приработе и исследовании активных илистых систем, используемых для очисткисточных вод,то можно использоватьантибиотик для получения селективного роста бактериальной флоры, сопровождающегося подавлением ростазагрязняющих грибковых или простейших организмов в образце. В этом 50случае образец добавляют к жидкойили твердой среде и на 1 мл средыдобавляют 0,1 мл раствора 10100 мкг/мл антибиотика в 1-ной сме -си метанол-вода, после чего образецинкубируют.Рможно также использовать в,качестве бактерицидного агента дляборьбы с болезнями растений, вызван882414 55 ными микроорганизмами, упомянутымивыше. Как случай типичного примененияР -4 используют в виде 1 0-ного метанольного водного раствора, содержа-,щего 0,5 мкг/мл - 5 мкг/мл антибиотикаТак, например, Рможно использовать для контроля за красновато-коричневой листовой гнилью, бластом,гельминтоспориозной пятнистостьюлистьев и листовым заболеванием рисовых растений,П р и м е р 1, 40 мл засеяннойкультуральной среды ( 1,0 0 глюкозы,2,0/ бактотриптона, 1,24 бактодрожжевого экстракта, рН 7,0 ) выливают в колбу Эрленмейера объемом200 мл. После стерилизации в среду(ЛГО 13726 : АТСС 31281 : ГЕКИ 3992)оИнокулянт инкубируют при 28 С вовращающемся шейкере (200 об/мин)для получения засеянной культуры.Эту засеянную культуру трижды промывают стерилизованной дистиллированной водой и промывные клетки выделяют до исходного количества стерили -зованной дистиллированной водой,1 мл полученного вещества инокули -руют в основную культуральную среду З ;растворимого крахмала, 0,2 0 хлористого аммония,0,05 сульфата магния,0,093 монокалийфосфата, 2,09 0 дикалийфосфата 0,001 0 сульфата железа,0,3 0 1.-лейцина), и основную культуральную среду выдерживают при 28 С8 дней во вращающемся шейкере(200 об/мин). Общее количество полученного С составляет 12 мкм/мли 80 его составляет ,Р,П р и м е р 2. Готовят тот же посевкультуры, что и в примере 1, и500 мл засеянной культуры выливают в колбу Сакагуши объемом 2000 мл,После стерилизации питательной средысреду инокулируют тем же штаммом,что и в примере 1, Инокулированнуюсреду культивируют при 28"С 48 ч свращательно-поступательным движением ( 110 ход/мин ) до получениязасеянной культуры, 100 л засеяннойкультуры ( 2,03 глюкозы, 3,0 0 растворимого крахмала, 1,0 0 жидкостизамоченного зерна, 1,0 0 соевой муки, 0,5 ; полипептона, 0,3 0 хлористогонатрия, 0,53 карбоната кальция,рН 7,0) готовят и выливают в 200 литровый ферментер из нержавеющейстали. После того как ферментерстерилизуют при 121 С 20 мин и охлаждают, в него инокулируют 500 мл засеянной культуры, Содержимое культивируют при 28 С 48 ч при скоростиаэрации 100 л/мин, скорости пере"мешивания 200 об/мин,Питательный бупьон ( 10 л ) помещают в 100 литров питательной среды(5 0 декстрина, 34 жидкости от замачивания зерна, 0,14 пептона, 0,5 1.1 о лейцина, 0,5 Ф карбоната кальция,рН 7,0 ) в 200-литровом ферментереиз нержавеющей стали. Ферментациюпроводят 4 дня при 28 С при скоростиаэрации 100 л/мин и скорости пере 15 мешивания 150 об/мин. Полное количество полученного Ссоставляет 12 мкг/мл, и РСсоставляет около 85 0(вес/вес),П р и м е р 3. К 95 л жидкой питательной среды, полученной в примере 2, добавляют 50 л ацетона. Полученную смесь перемешивают 30 мин.К полученной смеси добавляют 2 кгЬуГ 1 о-здрегсе 11 и полученную смесьхорошо перемешивают, Полученную смесьотфильтровывают на фильтре под давлением, в результате чего получают13,5 л фильтрата, К полученному фильтрату добавляют 50 л воды и 90 лэтилацетата, полученную смесь перемешивают и экстрагируют, Процедуруповторяют дважды, Полученные слоиэтилацетата объединяют и дважды промывают 80-литровыми порциями воды.К слою добавляют 1 кг безводного суль 35фата натрия, высушивают и концентрируют до 200 мл. К полученному концентрату добавляют петролейный эфир, иобразовавшийся осадок выделяют фильтрованием, в результате чего получа 40ют 35 г продукта.К полученному таким образом сырому продукту добавляют 50 мл этилацетата и полученную смесь перемешивают. Нерастворимую часть выделяютфильтрованием и к фильтрату добавляют10 г силикагеля. После перемешиванияполученной смеси этилацетат отгоняютпри пониженном давлении. Остаток помещают в верхнюю часть колонки ссиликагелем ( 500 мл), Элюированиепроводят последовательно 500 мл к -гек"сана, 500 мл смеси и - гексан: этилацетат ( 3:1), 2000 мл смеси н -гексан:этилацетат ( 1:1) и 2000 мл насыщенного водного раствора этилацетата,При этом элюат собирают в 50-миллилитровые фракции, По 1 мл от каждойфракции концентрируют досуха и к по8824 формула изобретения Составитель С.Иалютина Редактор И.Циткина Техред З.фанта Корректор Н,ШвыдкаяЗаказ 10009/88 Тираж 531 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Иосква, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул, Проектная, 4 лученному концентрату добавляют0,1 мл этилацетата до получениясмеси, Смесь дает пятно на расстоянии2,5 см от нижнего края пластины силикагель - стекло и проявляется около17 см растворителем (вода, насыщенная этилацетатом). После проявленияпроводят определение ультрафиолетовымизлучением ( 2537 А). Активные фракцииЮ 0,49 собирают. и концентрируют при 1 опонинФАном давлении до з 2 мл. К этомуконфАату добавляют 20 мл петролей"ного эфира,щ результате чего получают 1,08 г" Др 1 х кристаллов. Сырыекристаллы рЯтворяют в 20 мл теплого 5этилацетата. йосле охлаждения выделяют 920 мг. кфйсталлов Р, Темпеоратура подавления 178-180 С ( Р,9 М вес/вес).П р и м е р 4. В 400 мл 504 метано- ола растворяют 20 г сырого продукта,полученного в примере 3, Колонку ."2,5 см в диаметре набивают 1000 мл,диайона НРи готовят 3000 мл 503 ной смеси метанол-вода, Приготовленный таким образом раствор .образцапропускают через колонку и промывают, используя 1000 мл 60-ного метанола и последовательно проводятградиентное элюирование 7500 мл 603- звной смеси метанол-вода, 7500 мл 95 Фной смеси метанол - вода. Злюат собирают в 75 мл Фракции и каждую Фракцию исследуют тонкослойной хроматографией на силикагеле, описанной в при 35мере 3.фракции ММ 182-190 собирают и концентрируют. К полученному концентрату добавляют 500 мп воды и 1000 мл 14 16этилацетата. Получерный раствор встряхивают в разделительной воронке и водный слой отделяют, пьсле двухкратного промывания 300 мл воды этилацетатный слой высушивают над безводным сульфатом натрия, концентрируют и оставляют выстаиваться. В результате получают кристаллы, которые собирают фильтрованием и высушивают. Получают 950 кг Р. Температура плавления 177- 179 С ( Р, 924 вес/вес).П р и м е р 5. Используя методику примера 1, но вместо -лейцина применяя метиловый сложный эфир лейцина Й-метиламид лейцина, бС -кетоизокапроновую кислоту или гидрохлорид лейцина, получают тот же результат, а именно получают специфически требуемый Р.Предложенный способ позволяет получить новый антибиотик С Р. Способ получения антибиотикаСРо т л и ч а ю щ и йс я тем, что штамм Йосагд 1 а арМС(АТСС, ,1 РО 13726)выращивают в питательной среде, содержащей источники углерода и азотас добавлением лейцина или его производных.Источники информации,принятые во внимание при экспертизеПредложенный антибиотик новый испособ его получения в патентной инаучно-технической литературе не описан,