Способ получения циклических пептидов

ОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК ПАТЕНТУ Союз Советских Социалистических Республик(51)М. Кл.з С 07 С 103/52 //А 61 К 37/02 Государственный комитет СССР по делам изобретений и открытий(53) УДК 547.964.4 07 (088 8) ИностранцыДжон Лоренс Хьюз, Джей Кеннет СейЛери Роберт Чунг-Хуан Лиу(54),СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЦИКЛИЧЕСКИХ ПЕПТИДОВ Изобретение относится к способам получения циклических пептидов с замкнутым дисульфидным мостиком, обладающих биологической активностью, которые могут найти применение в медицине.Известен способ замыкания дисульфидного кольца в пептиде, содержащем два цистеиновых остатка, окислением соответствующего нециклического пептида 1 1.Основной недостаток известного способа состоит в том, что для его осуществления необходимо использование окислительных агентов, что может привести к загрязнению пептида продуктами его окислительной деструкции. и снижению, выхода целевого продукта. Кроме того, при окислении дисульфида кроме нужного циклического мономера образуются параллельные и антипараллельные димеры, циклические или линейные высшие полимеры. В результате выход основного продукта снижается до 35. 25Цель изобретения - повышение выхода и упрощение процесса получения циклических пептидов.Поставленная цель достигается тем, что.согласно способу получения циклических пептидов путем замыкания дисульфидного мостика в нециклическом пептиде, содержащем не менеедвух цистеиновых остатков, применяютисходный нециклйческий пептид, одиниэ цистеиновых остатков которого содержит свободную сульфгидрильнуюФункцию, а второй - сульфгидрильнуюфункцию, защищенную н-алкилтио группой, и выдерживают его в водном растворе, свободном от кислорода прирН от 5 до 10, в токе инертного газаПричем используют. водно-спиртовыйраствор, в качестве инертного газаприменяют азот, и процесс проводятпри рН 7,5Нециклические пептиды, содержащиедва цистеиновых аминокислотных остатка, которые являются промежуточными,имеют до отщеппения защитных группструктуру 5 х Вт.1 1-С 5- (А) -С 5-,а после кислотной. обработки, проведенной для отщепления защитных групп,структуру ВК1- СЭ 5- ( А) х - С т 5,где А - аминокислотный остаток; х - ноль или целое число; Гув - цистеиновый остаток;В - н-алкилтио-группа;Вг - бензильная группа или еепроизводное.Пептид имеет один цистеиновый остаток со свободной сульфгидрипьной функцией, второй цистеиновый остаток защищен н"алкилтио-группой. Такие пептиды выдерживают в растворе, лучшеводном или спиртовом, при рЙ от 5 до10 до тех пор, пока не пройдет самопроизвольная перегруппировка до соответствующего циклического дисульфидного пептида с вытеснением. н-алкилмеркаптана.П р и м е р 1, Синтез окситоцина.Активация смолы.5 г бензгидриламиновой смолы (ВНА) (5с титром амина 0,43 мэкЫ/г помещаютв реактор и обрабатывают следующимирастворителями, используя каждый раз20 мл порции и фильтруя после каждойобработки: метиленхлорид - 2 мин, 20хлороформ - два раза по 2,мин, 10-ныйтриэтиламин в хлороформе - два разапо 5 мин, хлороформ - 2 мин, метиленхлорид - три раза по 2 мин,Ц и к л 9. С о ч е т а н и е. дПеремешивают в течение 10 мин смолу(0,0043 моль) ВОС-глицина. Затем вреактор загружают 4,3 мл растворадициклогексилкарбодиимида в метиленхлориде (1 мэкв дициклогексилкарбодиимида на 1 мл раствора). Смесь перемешивают б ч. Смолу ВОС-глицин-ВНАотфильтровывают и подвергают следующим последовательным 2 минутным промывкам, каждый раз Фильтруя; метиленхлорид - (20 мл х 2), метиловый спирт(20 мл х 2), метиленхлорид - (20 мл хх 2),А ц е т и л и р о в а н и е. К 4 О смоле добавляют со смесью 1,б мл уксусного ангидрида, 2,4 мл триэтиламина и 20 мл хлороформа и перемешивают в течение 30 мин. Реакционную смесь фильтруют и смолу подвергают следующим промывкам, продолжая каждую в течение 2 мин, хлороформ- (20 мл х 2), метиловый спирт - (20 мл х х 2), метиленхлорид. - (20 кЯ х 3).Нингйдриновая проба отрицательна.С н я т и е з а щ и т ы. Смолу, защищенную ВОС, перемешивают 5 мин со смесью 12 мл трифторуксусной кислоты и 12 мл метиленхлорида. Фильтруют, и смолу перемешивают со второй смесью 12 мл трифторуксусной кислоты и 12 мл метиленхлорида в течение 30 мин. Смесь Фильтруют, и смолу промывают следующими растворителями, беря по 20 мл:. метиленхлорида -"2 ра за по 2 мин, метиловый спирт - 2 раза по 2 мин, хлороформ - 2 раза по 2 мин, 10-ный триэтаноламин в хлороформе - 2 раза по 5 и 10 мин, метиленхлорид - 2 раза по 2 мин, 65 Для смолы ВНАглицин титр амина или глицина,.составляет 0,384 мэкв амина или глицина на 1 г смолы.Цикл 8. Сочетание. -Глициновую смблу, 20 мл метиленхлорида и 2,95 г (0,0038 моль) ВОС-(.- -лейцина перемешивают в воде в течение 10 мин, Затем в реактор добавляют 3,8 мл раствора дициклогексилкарбодиимида в метиленхлориде (1 мэкв дициклогексилкарбодиимида (ОСС 1) на 1 мл раствора или всего 0,0038 моль ОСС 1). Смесь перемешивают 2 ч, затем реак,ционную смесь удаляют из реактора и смолу подвергают следующим последовательным 2-минутным промывкам, каждый раз фильтруя: метиленхлорид - (20 мл х 2), метиловый спирт - (20 мл х х 2), метиленхлорид - (20 мл х 2). Нингидриновая проба отрицательна..Снятие защиты. Вэтом цикле повторяют .методику снятия защитных групп, как вцикле 9Ц и к л 7. Сочетание и снятие защиты ведут, как в цикле 8, но вместо лейцинового производного используют 0,82 г (0.,0038 моль) ВОСпролина.Ц и к л б. Сочетание и снятие защитных групп проводят в условиях цикла 8. Ацетилирование, как в цикле 9. Для сочетания применяют 1,07 г (0,0038 моль) ВОС-этилтиоцистеин,Ц и к л . 5, С о ч е т а н и е. Пептидную смолу из цикла б дважды промывают, беря по 20 мл диметилформамида. Затем смолу перемешивают 24 ч с раствором 2,02 г (0,0057 моль) ВОС- аспарагин-п-нитрофенилового эфира в 25 мл диметилформамида, Реакционную смесь фильтруют и пептидную смолу подвергают последовательным двухминутным промывкам по 20 мл следующими растворителями; диметилформамид, метиленхлорид, метанол, метиленхлорид. Промывки отделяют фильтрованием. Нингидриновая проба отрицательна.Удаление защиты, Методика снятия защитных групп, как в цикле 8.Ц и к л 4. Сочетание .проводят в условиях, описанных в цикле 5. Ацетилирование - как в цикле 9. Снятие защитных групп - как в цикле 8. Применяют следующее аминокислотное производное: 2,09 г (0,0057 моль) л-нитрофенилового эфира ВОСглутамина.Ц и к л 3, Сочетание проводят в условиях, описанных в цикле 8. Сочетание повторяют, применяя смесь 10 мл диметилформамйда и 10 мл метиленхлорида, и такое же количество аминокислоты и дициклогексилкарбодиимида. Ацетилирование ведут, как в цикле 9. Снятие защитных групп, - как в цикле 8, Для реакции сочетания применяют О, 88 г (0,0038 моль) ВОСизолейцина.Цикл 2. Сочетание. Пептидную смолу из цикла 3 промываютдвумя последовательными порциями по20 мл диметилформамида. Затем нептидную смолу перемешивают 10 мин сосмесью 2,11 г (0,0057 моль) ВОС-о. -бензилтирозина и 20 мл диметилформамида. Затем добавляют 5,7 мл дициклогексилкарбодиимида в метиленхлориде (эквивалентно 0,0057 мольОСС 1), и смесь перемешивают 16 ч, затем фильтруют, Пептидную смолу подвергают 2-минутным промывкам по 20 мл 0каждая следующими растворителямипо2 раза: диметилформамид, метиленхлорид, метанол и метиленхлорид,Сочетание повторяют, применяя половину указанного количества аминокислотных производных и дициклогексилкарбодиимида в метиленхлоридепри перемешивании в течение б ч,А ц е т и л и р о в а н и е.Ведут, как в примере 9.Снятие защитных 20г р у и п. Ведут как в примере 9.Ц и к л 1. Сочетание ведут,как в цикле 8. Сочетание повторяют,применяя половину указанного количества аминокислотного производногои дициклогексилкарбодиимида в метиленхлориде. Снятие защитных групп ведут,как в цикле 9. В первой реакции со-,четания применяют 1,3 г (0,038 моль)ВОС-метоксибензилцистеина.По окончании цикла 1 пептиднуюсмолу последовательно промывают двумя порциями по 20 мл н-гексана. Пептидное вещество извлекают из реактора и сушат в электровакуумной печи при 40 ОС/0,1 мм рт.ст. в течение24 ч. Вес блокированной пептиднойсмолы окситоцина 6,0 г.Отщепление фторист ы м в о д о р о д ом. 2 г высушенной пептидной смолы и 2 мп анизола 40помеШают в тефлоновый реакторг снабженный магнитной мешалкойс тефлоновым покрытием. Реактор охлаждают вбане с сухим льдом и ацетоном. В реактор конденсируют 15 мл газообразного фтористого водорода. Смесь перемешивают при ООС на ледяной бане в течение 1 ч. Фтористый водород испаряютпри пониженном давлении, Остатокрастирают с 4-я 25 мл порциями этилацетата. Пептид экстрагируют со смолы 2 х 50 мл порциями ледяной уксуснойкислоты, Экстракт лиофилизируют, получают 486 мг отщепленного пептида.Цикл и за ци я.пе п тид ад о о к с и т о ц и н а. 200 мгсырого пентида растворяют в 50 млне содержащей кислорода дистиллированной воды с добавкой 1 млледянойуксусной кислоты. рН раствора доводят до 7,5 добавлением концентриро- Щванной гидроокиси аммония. Смесьперемешивают в герметичном сосудев токе азота 24 ч. К этому временив выходящем азоте уже не содержитсямеркаптана. Содержание этилмеркаптана д в выходящем азоте определяют, пропус-кая ток газа через раствор реагентаЭллмана. рН реакционной смеси доводятдо 3,5 добавлением ледяной уксуснойкислоты. Лиофилиэируют и получаюттвердый остаток.Очистка сырого о кс и т о ц и н а. Твердый остатокрастворяют в 0,5 н. уксусной кислотеи чистят, пропуская через колонку,заполненную Сефадексом 6 25 (тонкий),и элюируют 0,5 н. уксусной кислотой,Окситоциновую Фракцию иэ этой колонКи собирают и лиофилизируют, получают54 мп белого осадка. Осадок вновьрастворяют в 0,5 н.уксусной кислотеи чистят гель-Фильтрацией через Се-Фадекс 6-25 (тонкий), элюируют 0,5 нуксусной кислотой. Окситоциновуюфракцию собирают, лиофилизируют, получают пушистый белый осадок.Анализ продукта показал следующиеколичества аминокислот: 61 у 1,0; 1.ец0,98; Рго 0,97; Аьр 0,89; 61 а 0,84;11 е 0,74, Туг 0,72. Теоретическоеколичество должно составлять 1,0.Содержание Суэ не определяют, так какэта кислота разрушается при анализе.Биологическая активность полученногопродукта составляет 305,4 единицыка 1 мг.Этот способ может быть также приМенен к синтезу соматостатина,Пример 2. Сии те з человеческого кальцит о н и н а.Активация смолы.4 гбенэгидриламиновой смолы (ВНА) с аминовым титром 0,55 мэкв/г загружаютв реактор и обрабатывают 20 мл следующих растворителей, фильтруя послекаждой промывки. метиленхлорид2 мин, хлороформ два раза по 2 мин,10-ный триэтиламий в хлороформе двараза по 5 мин, хлороформ - 2 минметиленхлорид три раза по 2 мин.Цикл 32. Сочетание.Смолу ВНА, 20 мл метиленхлорида и0,95 г (0,0044 моль) ВОС-С-пролинаперемешивают 10 мин. В реактор добавляют 4,4 мл метиленхлоридного раствора дициклогексилкарбодиимида (1 мэкв0 СС 1 на 1 мп раствора) и смесь перемешивают б ч. Реакционную смесь отФильтровывают, и смолу ВОС.-пролил-ВНА ,подвергают последовательнымпромывкам, продолжительностью 2 минпо 20 мл растворителя, каждый раэФильтруя: метиленхлорид - 2 раза,метиловый спирт - 2 раза, метиленхлорид - 2 раза.Аце тилирование.Смолу перемешивают со смесью 1,5 млтриэтиламина, 1 мл уксусного ангид- фрида и 20 мл хлороформа в течение2 ч. Реакционную смесь отфильтровы-вают, и смолу промывают последовательно по 2 мин по 20 мл следующимирастворителями. хлороформ - 2 раза,60 65 метиловый спирт - 2 раза и метиленхлорид - 3 раза. Нингидриновая пробаотрицательна,Снятие з а щ и т н ы хг р у п и. Защищенную ВОС смолу перемешивают 5 мин со смесью 12,5 мл трифторуксусной кислоты и 12,5 мл метиленхлорида, Смесь фильтруют, и смолуперемешивают со второй смесью, состоящей из 12,5 мл трифторуксусной кислотыи 12,5 мл метиленхлорида в течение,30 мин, Реакционную смесь фильтруют,и смолу подвергают последовательнымпромывкам по 20 мл: метиленхлоридом -2 раза по 2 мин , метиловым спиртом2 раза по 2 мин, хлороформом 2 разаио 2 мин, 10-ным тризтиламином вхлороформе 2 раза ио 10 мин, хлороФормом 2 раза по 2 мин, метиленхлоридом 2 раза по 2 мин,Смолу 1.-пролин-ВНЛ титруют для,установления титра амина или пролина,Эта величина составляет 0,494 мэквамина или пролина на 1 г смолы.Цикл 31. Сочетание.-пролильную смолу, 20 мл метиленхлорида и 0,83 г (0,0044 моль) ВОСаланина перемешивают 10 мин, Затемв реактор добавляют 4,4 мл растворадициклогексилкарбодиимида в метиленхлориде (1 мзкв ОСС 1 на 1 мл раствора или всего 0,0044 моль ОСС 1),и смесь перемешивают 2 ч, Реакционную смесь отфильтровывают и полученную ВОСаланилпролил-ВН смолуподвергают последовательным 3-минутным промывкам ио 20 мл, каждый разФильтруя: метиленхлоридом 2 раза,метиловым спиртом 2 раза, метиленхлоридом 3 раза. Нингидриновая пробаотрицательна. Ц и к л ы 30-26. Сочетание и снятие защиты ведут, как в цикле 31, но вместо аланинового производного применяют следующие аминокислотные производные: цикл 30 - 0,77 г (0,0044 моль) ВОС-глицина, цикл 29 0,95 г (0,0044 моль) ВОС.-валина, цикл 28 - то же вещество, что в цикле 30, цикл 27 - 1,02 г (0,0044 моль) ВОС- - изолейцина, цикл 26 - то же вещество, что в цикле 31.Цикл 25. Сочетание. Пептидную смолу из цикла 26 дважды промывают 20 мл порциями диметилформамида, Затем ее перемешивают 10 мин со смесью 2,04 г (0,0066 моль) ВОС-р-бензил.-треонина и 20 мл диметилформамида, Добавляют 6,6 мл дициклогексилкарбодиимида в метиленхлориде (эквивалентно 0,0066 моль ОСС 1), и смесь перемешивают б ч. Реакционную смесь фильтруют. Пептидную смолу подвергают 2 минутным промывкам порциями по 20 мл в следующих растворителях: диметилформамид, метиленхло.рид, метиловый спирт, метиленхлорид. Нингидриновая проба отрицательна. С н я т и е з а щ и т ы. Ведут. как в цикле 32. Ц и к л 24 С о ч е т а н и е,Пептидную смолу из цикла 25 дваждыпромывают 20 мл:порциями диметилформамида. Затем смолу перемешивают24 ч с раствором 2,42 г (0,0066 моль)п-нитрофенилового эфира ВОСглутамина в 25 мл диметилформамиде. Реакционную смесь фильтруют и пептиднуюсмолу подвергают 2-минутным промыв 10 кам двумя последовательными порциямипо 20 мл каждая в следующих растворителях; диметилформамид, метиленхлорид, метанол, метиленхлорид. Каждыйрастворитель отфильтровывают. Нин 5 гидриновая проба отрицательна.С н я т и е з а щ и т ы, Ведут,как в цикле 32.Ц и к л 23. С о ч е т а н и е.Пептидную смолу из цикла 24 перемешивают. 10 мин с 1,42 г (0,0066 моль)ВОС.-пролина и 20 мл метиленхлорида,Добавляют 6,6 мл раствора дициклогексилкарбодиимида в метиленхлориде(эквивалентно 0,0066 моль ОСС 1), исмесь перемешивают 16 ч. Реакционнуюсмесь отфильтровывают, и пептиднуюсмолу подвергают последовательнымпромывкам по 20 мл каждая, продолжительностью 2 мин следующими растворителями: метиленхлорид, метиловый30 спирт, метиленхлорид. Каждую промывкуфильтруют, Нингидриновая проба отрицательна.С н я т и е з а щ и т ы. Ведуткак в цикле 32,35 Ц и к л 22, Сочетание и снятиезащиты ведут, как в цикле 23, но присочетании вместо ВОСиролина применяют 1,75 г (0,0066 моль) ВОС.-фенилаланина.40 Ц и к л ы с 21 п о 18, Сочетание и снятие защиты ведут, как вцикле 31, но вместо аланинового производного применяют следующие аминокислотные производные: цикл 21 -1,36 г (0,0044 моль) ВОС-о-бензил.45 -треонина, цикл 20 - 1,71 г(0,0044 моль) ВОС.-фенилаланина,цикл 18 " 1,67 г (0,0044 моль) ВОС50 -Е-карбобензилоксилизина.Ц и к л 17Сочетание и снятиезащиты ведут, как в цикле 24, новместо глутаминового производногоприменяют 2,33 г (0,0066 моль) п-ниф 55 тофенилового эфира ВОС.-аспарагина.Ц и к л ы 16 и 15.Сочетание и снятие защиты ведут, как в цикле 31, но вместо аланилового производного применяют следующие аминокислотные .производные: цикл 16 - 1,17 г(0,0044 моль)ВОС.-фенилаланина, цикл 15 - 1,42 гЦ и к л 13. Ведут так же, какцикл 21,Ц и к л 12, Сочетание и снятиезащиты проводят в условиях, описанныхв цикле 15, но вместо треониновогопроизводного берут 2,45 г (0,0066 моль).ВОС-о-бензил-(.-.тирозина, и перемешивают смесь 16 ч.Ц и к л 11. Ведут так же, какцикл 25.Ц и к л ы 10-7. Сочетание и снятие защит ведут, как в цикле 31, но 19в реакции сочетания вместо ВОС.-аланина берут следующие аминокислотныепроизводные: цикл 10 - 0,77 г(0,0044 моль) ВОС-этилтио.-цистеина.Ц и к л 6. Ведут так же, как 20 цикл 25.Ц и к л ы 5 и 4, Сочетание и снятие защиты ведут, как в цикле 31, но вместо ВОСаланина применяют следующие аминокислотные производные: цикл 5 - 1,3 г (0,0044 моль) ВОС-о-бензилсерина, цикл 4 - 1,02 г (0,0044 моль) ВОС.-лейцина.Ц и к л 3. Условия проведения те же, что и в цикле 17.Ц и к л ы 2 и 1. Сочетание и сня- З 0 тие защит ведут как в цикле 31, но вместо ВОСаланина применяют следующие аминокислотные производные: цикл 2 - 0,77 г. (0,0044 моль) ВОС- -глицина, цикл 1 - 1,5 г (0,0044 моль) З ВОС-п-метоксибензилцистеина,По окончании цикла 1 пеитидную смолу два раза промывают 20 мл порциями н-гексана. Пептидное вещество выгружают из реактора и сушат в 40 электровакуумной печи при 40 ОС и 0,11 мм рт.ст, в течение 24 ч. Вес блокированной пептидной смолы человеческого кальцитонина - 11 г.Отщепление фторист ы м в о д о р о д о м. 2 г высу 4 щенной пептидной смолы и 2 мл анизола помещают в теплоновый реактор, снабженный магнитной мешалкой с тефлоновым покрытием, и охлаждаемый в бане с ацетоном и сухим льдом. В реактор конденсируют 15 мл газообразного Фтористого водорода. Смесь перемешивают при 0 С на ледяной бане в течение 1 ч. Фтористый водород отгоняют при пониженном 55 давлении. Остаток растирают с 4 х 25 мл этилацетата. Пептид экстрагируют из смолы 2 х 50 мл ледяной уксусной кислоты. Экстракты лиофилизируют и получают 1063 мг отщепленного пеп- щ 0 тида.Циклизация пептида до человеческого кальцитонина. 1000 мг сырого пепгида растворяют в 250 мл не содержащей кислорода дистиллированной 65 воды с 1 мл ледяной уксусной кислоты,рН раствора доводят до 7,5 добавлением концентрированной гидроокисиаммония. Смесь перемешивают в герметичном сосуде в токе азота в течение24 ч, К этому времени в выходящемазоте уже не содержится этилмеркаптан.Содержание этилмеркаптана в выходящемазоте определяют пропусканием азотачерез раствор реактива Эллмана. рНреакционной смеси доводят до 3,2 добавлением ледяной уксусной кислоты,После лиофилизации получают твердыйпродут весом 985 мг,Очистка сырого человеческого кальцитонина, Твердый продукт растворяютв 0,5 н.уксусной кислоте и чистятгель-хроматографией на Сефадекс 6-25(тонкий), элюируют 0,5 н. уксуснойкислотой. Фракцию человеческого кальцитонина из этой колонки собираюти лиофилизируют, получают белый пушистый осадок, который растворяют в0,05 М водном ацетате аммония (рН=5).рН раствора доводят до 5 и растворчистят ионнообменной хроматографиейна колонне 511-Сефадекс 0-25. Продуктэлюируют буфером - ацетатом аммония.фракцию, содержащую человеческийкальцитонин, дважды лиофилизируют,получают пушистый белый осадок. Установлено, что это вещество биологически и химически эквивалентно продукту, описанному в литературе. Аминокислотный анализ (кислотный гидролиз)дает следующие количества аминокислот (теоретические величины даны вскобках); 1.ув 1,02 (1); Н 1 0,99 (1)1Аьр 3,28 (3)1 ТЬг 5,21 (5); 5 ег0,74 (1); 61 ц 1,95 (2); 01 у 4,33 (4);А 1 а 2,03 (2); Ча 1 1,04 (1); Мес0,86 (1); 11 е 1,07 (1); ец 2,24 (2);Суг 0,7 (1); РЬе 3,0 (3), Величиныдля Рго и Суь не определяют. Биологическая активность составляет 100 МИединиц на 1 мг.Этот способ может быть примененв синтезе вазопрессина, свинного кальцитонина, бычьего кальцитонина.П р и м е р 3. Синтез кальцитонина лосося.Активация смолы. 5 гсмолы ВНА с титром по амину 0,61 мэкв/гпомещают в реактор и обрабатываютрастворителями, каждый раз беря по25 мл соответствующего растворителяи фильтруя реакционную массу послекаждой обработки: метиленхлорид -2 мин, хлороформ - 2 мин по два раза,10-ный триэтиламин в хлороформе -5 мин по два раза, хлороформ - 2 мин,метиленхлорид - 2 мин по три раза.Ц и к л 32. С о ч е т а н и е,Смолу ВНА, 25 мл,метиленхлорида и1,29 г (0,006 моль) ВОС.-пролинаперемешивают 10 мин, добавляют 6,0 млраствора дициклогексилкарбодиимида6 ч. Смолу ВОС-пролин-ВНА отфильтровывают и подвергают следующим последовательным 2-.минутным промывкам: - метиленхлоридом (2 х 25 мл), метиловымспиртом (2 х 25 мл) и вновь метиленхлоридом (Зх 25 мл). После каждойпромывки смолу фильтруютАцетилирование, Ксмоле добавляют смесь 1,5 мл триаэтиламина, 1 мл уксусного ангидрида и25 мл хлороформа и перемешивают в течение 2 ч, затем фильтруют и смолупромывают следующими растворителями: хлоРоформом (2 х 25 мл), .метиловыйспирт (2 х 25 мл), метиленхлорид(Зх 25 мл). Каждая промывка длится2 мин.Удаление з ащит ныхг р у и и. Смолу, защищенную ВОС,перемешивают 5 мин в смеси 15 млтрифторуксусной кислоты и 15 мл метиленхлорида, фильтруют, вновь перемешивают с этой же смесью растворителей в течение 30 мин. Фильтруюти смолу промывают растворителями,беря их по 25 мл: метиленхлоридом(2 х 25 мл), метиловым спиртом (2 х 25 мл),хлороформом (2 х 25 мл), Каждая промывка продолжается 2 мин, 10-нымтриэтиламином в хлороформе (2 х 25 мл) -10 мин, хлороформом и метиленхлоридом (2 х 25 мл). Две последние промывки также продолжаются 2 мин. Длясмолы -пролин-ВНА устанавливают титрамина или пролина. Эта величина равна 0,55 мэкв амина или пролина на1 г смолы.Ц и к л 31. С о ч е т а н и е,Смесь, содержащую смолу 1 -пролина,25 мл метиленхлорида и 1,7 г(0,0055 моль) ВОС-о-бензил.-треонинаперемешивают 10 мин. Затем в раствордобавляют 5,5 мл раствора дициклогексилкарбодиимида (1 мэкв ОСС на1 мл раствора или всего 0,0055 мольОСС 1) в метиленхлориде, и смесь перемешивают в течение 2 ч. Реакционнуюсмесь фильтруют, и смолу подвергаютследующим последовательным 2-минутнымпромывкам: метиленхлорид (2 х 25 мл),метиловый спирт (2 х 25 мл), метиленхлорид (Зх 25 мл). Нингидриноэая реакция отрицательна.Снятие з а щ и т н ы хг р у и п. Проводят в условиях, описанных для цикла 32.Ц и к л ы 30-27. Применяют методику сочетания и удаления защитныхгрупп, как в цикле 31, но вместо треонинового производства используютследующие аминокислотные производные:цикл 30 - 0,97 г (0,0055 моль) ВОС-глицина цикл 29 - 1,62 г(0,0055 моль) ВОС-о-бензил-.-серина;цикл 28 - то же соединение,что и вцикле 30; цикл 27 - то же соединение, что и в цикле 31.Ц и к л 26. С о ч е т а н и е,Пептидную смолу из цикла 27 промывают диметилформамидом (Зх 25 мл), Затемсмолу перемешивают 24 ч с раствором2,9 г (0,008 моль) п-нитрофениловогоэфира ВОС- -аспарагина в 35 мл диметилформамида, Реакционную смесь фильтруют и пептидную смолу подвергают2-минутным промывкам последовательноследующими растворителями: диметилформамид, метиленхлорид, метанол,метиленхдорид, каждый раз беря по25 мл. Растворитель отделяют фильтрованием, Нингидриновая проба отрицательна.Удаление защитныхг р У п п. Проводят в условиях, описанных для цикла 32.Ц и к л 25, Сочетание и удалениезащитных групп осуществляют в условиях, описанных для цикла 31, применяя те же вещества в таких же количествах.20 Ц и к л 24. С о ч е т а н и е.Пептидную смолу из цикла 25 промываютдвумя последовательными порциями по25 мл диметилформамида и перемешивают10 мин со смесью 3,43 г (0,08 моль)ВОС-Р 1-у.-аргинина в 25 ми диметилФормамида. Затем добавляют 8 мл дициклогексилкарбодиимида в метиленхлориде (эквивалентно 0,008 моль ОСС 1),смесь перемешивают 6 ч, Фильтруют.30 Пептидную смолу подвергают двухминутным промывкам следующими растворителями. диметилформамид (2 х 25 мл),метиленхлорид (2 х 25 мл), метиловыйспирт (2 х 25 мл), метиленхлорид(0,008 моль) ВОС-.-пролина и 25 млметиленхлорида . Добавляют 8 мл 4 дициклогексилкарбодиимида в метиленхлориде (эквивалентно 0,008 моль ОСС 1)смесь перемешивают 6 ч, фильтруюти пептидную смолу подвергают двухминутным промывкам следующими растворителями: метиленхлорид (2 х 25 мл),метиловый спирт (2 х 25 мл), метиленхлорид (2 х 25 мл), После каждой промывки смолу отфильтровывают. Нингидриновая реакция отрицательна.Удаление защитныхг р у п п. Проводят в условиях, описанных в цикле 32.Ц и к л ы 22 и 21, Условия, в которых проводят сочетание и удалениезащитных групп, описаны в цикле 24, 0 но в реакции сочетания вместо ВОС-.-пролина применяют следующие аминокислотные производные: цикл 22 -2,97 г (0,008 моль) ВОС-о-бензил-.- -тирозина, цикл 21 - 2.47 г 65 (0,008 моль) ВОС-о-бензил-.-треонина.ЗО Удаление защитныхг р у п п. Проводят, как описано вцикле 32.Ц и к л 7. Методика из цикла 31,но при сочетании вместо треониновогопроизводного применяют 1,55 г(0,0055 моль) ВОС-этилтиоцистеина.Ц и к л б. Вещества и методикаописаны в цикле 31.Ц и к л 5. Вещества и методикаописаны в цикле 29.,Ц и к л 4. Вещества и методикаописаны в цикле 19.Ц и к л 3. Вещества и методикаописаны н цикле 26.Ц и к л 2. Вещества и методикаописаны в цикле 29. 55 Ц и к л 20. Методика та же, чтоописана в цикле 26, но вместо аспарагинового производного применяют 3,0 г(0,008 моль) и-нитрофенилового эфираВОСглутамина.Ц и к л ы 19-15. Методика та же,что описана в цикле 31, но вместотреониновых производных берут следующие аминокислотные производные:цикл 19 - 1,37 г (0,0055 моль) ВОСлейцина цикл 18 - 2 09 г10(0,0055 моль) ВОС-(.-карбобензилоксилизина цикл 17 - 2,58 г (0,0055 моль)ВОС-Й-в)-карбобензилокси-(.-гистидина цикл 16 - как в цикле 19,фцикл 15 - 1,85 г (0,0055 моль) у-бензилового эфира ВОСглутаминовой 15кислоты.Ц и к л 14. Условия реакции описаны в цикле 20,Ц и к л 13. Методика такая же,как в цикле 23, но вместо пролоновых 20производных берут в реакциюсочетания2,36 г (0,008 моль) ВОС-о-бензил. --серина.Ц и к л ы 12-9. Методика такаяже, как в цикле 31, но в реакциюсочетания вместо треонинового производного берут следующие аминокислотные производные: цикл 12 - то же вещество, что в цикле 19, цикл 11то же вещество, что в цикле 13;цикл 10 - то же вещество, что.и вцикле 30, цикл 9 - то же вещество,ч.о и в цикле 19.Ц и к и 8С о ч е т а н и е.Пептидную смолу, полученную в цикле9, перемешивают 10 мин с 1,79 г35(0,008 моль) ВОСвалина и 25 млметиленхлорида. Затем добавляют 8 млдициклогексилкарбодиимида в метиленхлориде (эквивалентно 0,008 мольОСС 1), и смесь перемешивают 16 ч. 40Пептидную смолу отфильтровывают иподвергают 2-минутной промывке следующими растворителями; метиленхлорид (2 х 25 мл), метиловый спирт(2 х 25 мл), метиленхлорид (2 х 25 мл). 4После каждой промывки смолу Отделяютфильтрованием. Ц и к л 1. Методика описана в цикле 31, но вместо треонинового производного применяют 1,88 г (0,0055 моль) ВОС-п-метоксибензилцистеина,По окончании цикла 1 пептидную смолу промывают н-гексаном (2 х 25 мл), отфильтровывают и сушат в электрической вакуумной печи при 40 С и давлении 0,1 мм рт,ст.в течение 24 ч,Расщепление ф т о - р и с т ы м в о д о р о д о м. 16 г смеси сухой пептидной смолы и 16 мл анизола помещают в реактор из тефлона, снабженный покрытой тефлоном магнитной мешалкойРеактор: охлаждают в бане из сухого льда и ацетона и конденсируют в нем 100 мл Фтористого водорода. Эту смесь перемешивают при ОфС на ледяной бане в течение 1 ч. Фтористый водород упаривают при пониженном давлении. Остаток растирают в этилацетате (бх 100 мл). Пептид экстрагируют 800 мл 0,1 М водного раствора уксусной кислоты.Циклизация пептида н лососевый кальцитонин, Водно-уксуснокислый эКстракт пептида, полученного после отщепления смолы фтором водорода, разбавляют до 1,5 л 700 мл дистиллированной воды, рН раствора доводят до 7,5 добавлением концентрированной гидроокиси аммония, Раствор перемешивают в герметичном сосуде н токе азота в течение 24 ч. За это время весь отщепившийся этилмеркаптан уходит с током азота. Содержимое этилмеркаптана н токе азота определяют с помощью;реагента Эллмана, рН реакционной смеси доводят до 5,0 ледяной уксусной кислотой. Очистка сырого лососевого кальцитонина, 1,5 л полученного раствора с рН 5,0.концентрируют с помощью ионнообменной колонки 50-Сефадекс 6-25. Получают 75 мл концентрата в 0,5 М растворе хлористого натрия, его обессоливают, чистят гель-фильтрацией через Сефадекс С(мелкий), элюируют 0,03 М водной уксусной кислотой, Фракцию лососевого кальцитонина из этой колонки донодят до рН 6,0 раствором гидроокиси аммония. Раствор чистят ионнообменной хроматографией на колонке, заполненной Ватман СМ 52. Для элюирования используют аммонийацетатный буфер. рН фракции лососевого кальцитонина из колонки доводят до 5,0 ледяной уксусной кис- лотой. Раствор концентрируют на ионнообменной колонке с Сефадексом С. 30 мл концентрата, выведенного из колонки 0,5 М раствором хлористого натрия, обессолинают гель-фильтрацией на колонке с Сефадексом 0-25 (тонкий). Очищенную Фракцию лососе- ного кальцитонина сушат вымораживанием. Продукт получают в виде пушис" того белого твердого вещества.16 Составитель В. Волкова Техред М, Рейвес Корректор М. Шароши Редактор Н. Егорова Заказ 6139/82 Тираж 443 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытийФилиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Аминокислотный анализ (кислотный гидролиэ) дает следующие количества аминокислот (теоретические величины даны в скобках): Агу 1,05 (1); Аьр 1,84 (2); бац 3, 14 (3); 6)у,3,06 (3); Нь 0 94 (1) р ец 5,01 (5) р (ув 1,94 (2)Рго 2,11 (2); 5 ег 3,86 (4); ТЬг 5,15 (5); Туг 0,85 (1) р Ча 1 0,95 (1) .Содержание Сув не определяют.П р и м е р 4. Методику из примера 3 повторяют, применяя те же вещества, в таких же количествах при всех равных условиях, насколько это практически возможно, но в цикле 24 ВОС-й-тозил-(.-тироэин заменяют 2,5 г (0,008 моль) ВОС-М-нитроаргинина. Полученные результаты почти идентичны тем, что описаны в примере 3.П р и м е р 5. Повторяют методику примера 3, применяя те же вещества, в тех же количествах и при тех же условиях,но в цикле 22 вместо ВОС- -о-бензилтирозина берут 3,45 г (0,008 моль) ВОС-о-бромбензилоксикарбонил-(.-тирозина, Результаты аналогичны полученным в примере 3.П р и м е р б, Все методики, вещества и условия применяют как в примере 4,но и в циклах 18, и 11 ВОС-Я-бензилоксикарбониллизин заменяют 2, 28 г О, 005 5 моль ВОС-Я.-2-хлорбензил-оксикарбониллизином. Получают результаты, совпадающие с описаннымив примере 3,. ФорМула изобретения1. Способ получения циклическихпептидов путем замыкания дисульфидного мостика в нециклическом пепти-.де, содержащем не менее двух цистеиновых остатков, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью повышения выхода и упрощения процесса,применяют исходный нециклическийпептид, один из цистеиновых остатковкоторого содержит свободную сульфгидрильную функцию, а второй - сульф 15гидрильную функцию, защищенную н-алкилтио-группой, и вццерживают егов водном растворе, свободном от кислорода при рН от 5 до 10, в токеинертного газа.2, Способ по п.1, о т л и ч а ю -20 щ и й с я тем, что применяют водно-,спиртовый раствор.3. Способ по п.1, о т л и ч а ю -щ и й с я тем, что в качестве инертного газа применяют азот.4. Способ по п.1, о т л и ч а ю -щ и й с я тем, что процесс проводятпри рН 7,5.Йсточники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Шредер Э., Любке К. Пептиды,М "Мир", 1967, с. 350.