Способ получения пептидов

ОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК ПАТГНТУ п 668594 Союз Советскна Соцналнстнческнк Реслублнк(83) С Государственный комите 1 СССР ио делам изобретени и открытий,407(088.8) Опубликовано 150379,Бюллетень2Дата опубликования описания 180379 72) Авторы изобретени ИностранцыЭндрю Виктор Иалли (США)Д=1 фид Уовард Кой (Великобритания) Заявители 54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДОВ 2 Изобре лучения н биологиче гут найти диагности редсьчад В пептитидной цепфазный мевых защитимерной осристый вод пеп- ердо- окополи тодной химии д и широко исп я синтезльзуют тдал ения,епленияименяют този2-бробензводов ак 1 твсе од 1, Для у ых групп и от овы широко пр ород с анизол обрабатотцепитнову. ом Цель изо ептидов, о огическими етения - синтез новыхадающих ценными фармако1войствами,Предпочтительным варианто ба является использование дл ния защитных групп и полимер вы фтористого водорода, Проц при 0-250 С в течение 30 мин,спосоудалей оснос ведут ся предптидов 20П р и м е р 1. Синтез Ь-пироглутамил-Ь-гистидил(тоэил)-Ь-триптофил-Ь-серил(бензил) -Ь-тироэил (2-бром"бенэилоксикарбонил)-Р-триптофчл-лейцил-Ь-аргинил(тоэил)-Ь-пропилглицнлбензгидриламиновой смолы йф-(руго)СсцН 1 я(е 11 -й )-Тгр-ег(йз) -Туг.(й)-РТгр-Ьец-Агд(Ф-й ) -Рго-СГ уА1, 2згде й -Тоя; й-Вг-С 52 С; 1 с- Взс )й -Н А - бензгидриламнновая смола-й )-Тгр-Х(йа)- -й 1)-Ргоа азаны выае; ение относится к способу повых пептидов, обладающихкой активностью, которые моприменение в медицине дляи и терапии Поставленная цель достигаетлагаемым способом получения пеобщей формулы Груго С 3 ц-Н 1 я-Тгр-Х-ТуРго где Х - Зег;У - Р-Тгр, Р-РЬе;.2 - СуЫН.,заключающимся в том, что соединениеформулы ий -(руко)Сц-Ня(ИТуг(й ) -У-Ьец-Агд (Иагде значения Х и У ук г 1-СН - Р)т - (лояояерНая осно1 1 соей Бензгодролалоа 5 ую слав;Рмбензилоксикарбонилтл;род (реагентом, погру ппы и пол и м668594 содержащая в своем состане группировки типа бензгидриламина).1,25 (1,0 ммоль) бензгидриламиноной смолы помещают в реакционный сосуд автоматического пептидного синтезатора фирмы Бекман (Модель 990), запрограммированного на проведение следующего цикла промывокг г) метиленхлоридом; б) 33-ным раствором трифторуксусной кислоты н метиленхлориде (2 раза в течение 2,5 и 25 мин); н) метиленхлоридом; г) этанолом; д) хлороформом; е) 10-ным раствором триэтиламина в хлороформе (2 ч по 25 мин); ж) хлороформом; з) меиленхлоридом,10 15 Затем н реактор вводят следующую по счету (с С-конца синтезируемого пептида) И-защищенную аминокислоту (3,0 ммоль) и всю последовательность 40 операций повторяют, как описано выше, Осуществляют наращивание пептидной цепи следующими аминокислотами (каждую из которых нводят в реактор в количестве 3,0 ммоль), повторяя анало гичный цикл промывок и обработок:.1-Вос-Ь-пролину 1-Вос-Ь-аргинин-(Тов);1-Вос-Ь-лейцин; 1-Вос-Р-триптофан;1-Нос-Ь-тироэин (2-бромбензилоксикарбонил); г-Вос-Ь-серин (ВЫ ); 1-Вос-Ь-Три птофан; 1-Вос-Ь" гистидин (Тон ); Ь-пироглутаминовая кислота. После завершения синтеза декапептидную смолу промывают метиленхлоридом (3 раза), затем.метанолом (3 раза) и сушат в вакууме до постоянного веса, В итоге получают принес, равный 98 от ожидаемого теоретического привеса смолы,Бензгидриламиновая смола, использованная в этом примере, приобретена у фирьы фБэхем Инкорпорейтед в Марина дель Рей, Калифорния и получена с 65 использованием 1 сшивающего агента. Промытую смолу перемешинают с 0,525 г (3,0 ммоль) трет-бутилоксикарбонилглицина в метиленхлориде н присутствии 3,0 ммоль дициклогексилкарбодиимида, Реакционную смесь пере мешинают при комнатной температуре (22-25 С)2 ч, осле,чего аминокислотную смолу (т.е. полимерную подложку с присоедйненным к ней остатком трет-бутилоксикарбонилглицина) промывают последовательно метиленхлоридом (3 раза), этанолом (3 раза) и метиленхлоридом (3 раза). Далее присоединенную аминокислоту деблокируют 33-ным раствором трифторуксусной кислоты н метиленхлориде (двукратная обработка30 продолжительностью 2,5 и 25 мин каждый раз) и промывают в соответствии с заданной программой, т.е. осуществляют весь цикл промывки, описанный выше, от стадии н) до стадии з). П р и м е р 2. Синтез Ь-пироглутамил-Ь-гистидил-Ь-триптофил-Ь"серил-тирозил-О-триптофил-Ь-лейцил-Ь-аргинил-Ь-пролил-глицинамида, т,е, пептида формулы1, где Х - Бег; у - О-Тгр;г - Су-ИН;(руго)С 1 и-Н 1 в-Тгр-Бег-Туг-Тгр-ЬецАгд-СгуИН 2 . Удаление защитных групп иотщепление синтезированного декапептида от декапептидной смолы, описанной в примере 1, проводят путем обработки 1 г последней 24 мл жидкого фтористого водорода и 6 мп аниэола припри 0 С в течение 30 мин, Фтористыйводород удаляют при пониженном давлении, а для удаления аниэола остатокпромывают этилацетатомСырой пептид чистят гель-фильтрацией на колонке (2,5 х 100 см) с сефадексом Г(марки Файнф), представляющим собой химически модифицированный, поперечносшитый декстран,причем элюцию осуществляют 2 М раствором уксусной кислоты в воде, Фракции,которые по данным УФ-спектроскопииимеют основные пики поглощения в области 280 нм, объединяют и упаринаютдосуха. В остатке получают вязкий маслообразный продукт, который вносятв колонку (2,5 х 100 см) с сефадексомГ, гредварительно уравновешеннымсначала с нижней фазой, а затем сверхней фазой системы растворителейн-бутанол:уксусная кислота: вода(4,1:5). Элюция с помощью верхней фазы этой системы растворителей даетФракцию с одним оснонным пиком поглощения, Вещество, выделенное из этойфракции, подвергают элюции на колонке(1,4 х 94 см) с карбоксиметилцеллюлозой, Соответствующие фракции (10501190 мл) подвергают лиофилизации допостоянного веса и в остатке получают целевой продукт в виде белого пушистого порошка, выход 80 мг, Удельное вращение (о )В = "58,8 (с"-0,33;1 н, уксусная кислота).По данным тонкослойиой хроматографии в четырех различных системах растворителей при нагрузке на пластинку20-30 мкг вещества и проявлении парами йода с последующей обработкойпластинки реактивом Эрлиха (пятна наблюдали визуально), продукт показалсебя однородным веществом, Ниже приводятся величины М, полученные прихроматографии в различных системах:1-бутанол:уксусная кислота;вода:1 М уксусная кислота (2:1) ВГ:0,38)1-бутанол:уксусная кислота: вода:зтилацетат (1:1:1:1) М:0,51. Аминокислотный анализ продукта дал следующие результаты: Юи -1,08; Н 1 в 0,95; Тгр,00) Бег,94; Туг"0,97Ьец-Ор 93; Лгу. 0,98; Рго,00)Жу"1 02 у ИН,03,П р и м е р 3. Синтез Ь-пироглутамил- Ь-гистидил(тоэил)-Ь-триптофил-Ь-серил(бензил)-Ь-тироэил (2-бромбенэилоксикарбонил)-Р-фенилаланил-Ь-лейцил.-аргинил(тоэил)-Ь-пропилглицилбензгидриламиновой смолы:В 4 (руго)Сц-Н 1 я(Иф-Н )-Тгр-Яег(В) - 5Туг(В)-Р.-РЛе-Ьец-Агд(И-Н)-РгоС 1 у А,где В -Тоя; Н -2-ВгСЬк; В -Вя 1; В -Н;2 Ь 4А - нерастворимая полимерная подложка бензгидриламинного типа, 01,25 г (1,0 ммоль) бенэгидриламиновой смолы помещают в реакционный сосуд Бекмановского автоматического синтезатора пептидов (модель 990), запрограммированного на проведение следую- ) 5щего промывного цикла: а) метиленхлоридом; б) 33-ным раствором трифторуксусной кислоты в метиленхлориде (2раза в течение 2,5 и 25 мин; в) метиленхлоридом; г) зтанолом; д) хлороформом; е) 10-ным раствором триэтиламина в хлороформе (2 раза по 25 мин);ж) хлороформом; з) метиленхлоридом,После такой промывки смолу перемешивают с 0,525 г (3,0 ммоль) трет-бутилоксикарбонилглицина в метилен:.лориде, куда прибавляют 3,0 ммоль дициклогексилкарбодиимида. Реакционнуюсмесь перемешивают при комнатной температуре (22-25 фС) 2 ч, после чегополученную аминокислотную смолу промывают последовательно метиленхлоридом (3 раза), зтанолом (3 раза) и метиленхлоридом (3 раза), Аминокислоту,присоединенную к полимерной подложке,деблокируют обработкой 33-ным раствором трифторуксусной кислоты в метиленхлориде (2 раза в течение 2,5 и25 мин), после чего смолу промываютв соответствии с заданной программой,т,е. осуществляют весь цикл промывки, 40описанный выше, от стадии в) до з).Далее проводят наращивание пептиднойцепи ступенчатым методом - посредством последовательной конденсации следующих И-защищенных аминокислот, повторяя каждый раз весь цикл промывоки обработок: 1-Вос-Ь-пролин) -Вос-Ь-аргинин(Тоя); г.-Вос-Ь-лейцин; 1-Вос-Р-фенилаланин; с-Вос-Ь-тироэин (2-Вг-СЬк) с-Вос-Ь-серии(Вг 1) г-ВосФ50-Ь-триптофан; С-Вос-Ь-гистидин (Тоя);Ь-пироглутаминовая кислота. После завершения синтеза полученную декапептидную смолу промывают метиленхлоридом (3 раза), затем метанолом (3 раза) и сушат в вакууме до постоянноговеса. В итоге получают 100-ный оттеоретического привес смолы,Бенэгидриламиновая смола,.использованная в этом примере, аналогична смоле примера 1. 60П р и м е р 4, Получение Ь-пиро- глутамил-Ь-гистидил-Ь-триптофил-Ь-серил-Ь-тироэил-Р -фенилаланил-Ь-лейцил- -Ь-аргинил-Ь-пропил-глицинамида, т,е, пептида формулы 1,в которой Х - Яег; У -Р-РЛе; ЕСУЫН;(руго)С 1 ц-Нз-Тгр-Яег-Туг-Р-РЛе-ЬецАгд-Рго-ССуикудаление защитных групп и отщепление синтезированного декапептида отсмолы, описанной в примерз 3, осуществляют посредством обработки 1,5 г материала 24 мл фтористого водородаи 6 мл аниэола при ООС в течение30 мин. Фтористый водород удаляют припониженном давлении, а анизол - промывкой остатка этилацетатом.Сырой пептид чистят гель-фильтрацией на колонке (2,5 х 100 см) с сефадексом Г, представляющим собойхимически модифицированный сшитыйдекстран, причем элюцию вещества осуществляют 2 М водным раствором уксусной кислоты. Фракции, которые по данньм УФ-спектроскопии дают основнойпик поглощения в области 280 нм,объединяют и упаривают досуха в вакууме.Полученный в результате масло- образный продукт наносят на колонку(2,5 х 100 см) с свфадексом Г,предварительно уравновешенным сначала с нижней фазой, а затем с верхнейфазой системы растворителей н-бутанол:уксусная кислота: вода (4:1;5). Элюция с помощью верхней фазы этойсистемы растворителей дает фракции, которые выходят иэ колонки одним основным пиком (по содержанию желаемого вещества). Эти фракции объединяют и упаривают досуха при пониженном давлении. Остаток лиофилизуют из 0,2 н. уксусной кислоты, в результате чего получают целевой продукт в виде белого пушистого порошка. Выход продукта158 мг; удельное вращение (с. ) = -57,5 (с:0,55; 0,1 н. уксусная кислота) .Судя по результатам тонкослойной хроматографии в четырех различных системах растворителей (при нагрузке на пластинку 20-30 мкг вещества и проявлении пятен путем выдерживания пластинок в парах йода с последующей обработкой реактивом Эрлиха), полученный продукт представляет собой совершенно однородное вещество, Величины И , полученные при ис-.ользовании различных систем растворителей для ТСХ, приведены ниже: 1-бутанол: уксусная кислота:вода (4:1:5, верхняя фаза) М=0,14; этилацетат:пиридин:уксусная кислота: вода (5:5:1:3) Нй:0,68 р 2-пропанол: ,1 М уксусная кислота (2:1) НЕ=0,41 р 1-бутанол: уксусная кислота: вода:этил- ацетат (1:1:1:1) М:.0,47. Аминокислотный анализ полученного продукта дал следующие результаты; СИц,01; Н 1 я,97 у Тгр,90 р Яег,92 уТуг,00 у РЛе,96 уЬец,00; Агд,02 у Рго,95 у аЕу,00; МН,ОО.Формула изобретения1. Способ получения пептидов общей )формулы 166859рухо Иц-Н 1 э-Тгр-Х-Туг-У-Ьец-АгдРго-Егде Х " Бег;Х - Э-тгр, И-РЬе;г - ицянго т л и ч а ю щ и й с я тем, чтосоединение формулы 1 5й-(руто)бац-Н 1 э (Н -К )-Тгр-Х(КЗ)Туг(К)-У-Ьец-Агу(й"-К)-Рго-Еггде Х и У имеют указанные значения;г-сеу ь,10где А- М-СН- Рь-полимерная осноба),Н РЬлредсаабляющая содой бенэгидролдминоЬую смалу;, К тозилгК - 2-бромбензилоксикарбонил; 4 8К - бензил;ъКф - водород,обрабатывают реагентом, позволяющимотщепить все защитные группы и полимерную основу,2. Способ по п. 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что отщепление защитных групп и полимерной основы осуществляют фтористым водородом при 0-25 фСв течение 30 мин.Источники информации, принятые вовнимание при экспертизе1. Стюарт Д. М., Дженнис Д. Твердофазный синтез пептидов, М., Мир,1971.2, Чьъъес 5., Ке Ьпф К Х.Т, 5 Ьзд 1 ез оп ройурер 11 оеэ, Ра(. Я,ТЪафгпеий сопдепъаБоп Ьуас 3 е соорГтп нч 1.й а роГцгпЕг- бомпд рер-бде, Уес,Тгач. СИеа 1970, 89, 880.Составитель В. ВолковаР акто Е Хо ина Тех е И. Асталош Ко екто М, ПожоЗаказ 3331154 Тираж 512 ПодписноеЦНИ)1 ПИ Государственного комитета СССР по делам иэобретений и открытий 113035 Москва Ж"35 Ра ская наб д. 415 филиал ППП ффПатент 1, г, Ужгород, ул, Проектная, 4