Способ получения -лизина

Союз Советских Социалистических Республик(5)М. Кл.з С 12 0 13/06 Государственный комитет СССР но дедам изобретений и открытий(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ -ЛИЗИНА Изобретение относится к технике получения -лизина путем культивирова" ния микроорганизмов, используемого для приготовления пищевых продуктов и повышения их питательных свойств, 5Наиболее близким к изобретению является известный способ получения .-лизина путем культивирования продуцирующих его микроорганизмов рода СогупеЬасйегцв или ВгечЬастегцв 1 О на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, необходимые минеральные соли в присутствии антибиотиков или поверхностно-активных веществ, или антиокислителей с 15 последующим выделением целевого продукта 1 .Однако по известному способу выход -лизина недостаточно высокий,Для повышения выхода Ьлизина в 20 предлагаемом способе иэ рода Согупе-. Ьасйегоа или ВгечЬассегоа используют штаммы СогупоЬасйегое цотавсце ГЕВМР, ГЕВМР,ГЕВМР- -198 или ВгечЬасеегоа асео Г е г вте и е ов Г Е ВНР, Г Е ВМР, ГЕВМР"1857, ГЕВМР, ГЕВМР, ГЕВМРт ГЕВМР. Культивирование ведут на среде, содержащей в качестве источника углерода углеводы 2или спирты,или органические кислоты, в присутствии антибиотиков, выбранных из группы хлорамфеникол, эритромицин, диоксистрептомицин, тетрациклин, или поверхностно-активных вещес в или антиокислителей в количествах, соответственно равных 3,525 мг/мл, 0,05-2 или 0,05-1,0 мг/мл,спосоо осуществляют следующим образом.Продуцирующие .-лизин микроорганизмы иэ рода СогупеЬасссгцв или ВечЬасйегцв культивируют на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и необходимые минеральные соли в присутствии антибиотиков, или поверхностно-активных веществ, или антиокислителей, в количествах, соответственно равных3,5-25 мг/мп, 0,05-2 и 0,051,0 мг/мп.Из рода СогупеЬасегоп или ВгечЬассегцнт используют штаммы СогупеЬасСегцпт 9.ойащсцщ ГЕВМР, ГЕВМР, ГЕВМРили Вгеч 1- ЬасСегца 1 астоГегвепйов ГЕВМР, ГЕВМР, ГЕВМР, ГЕВМР, ГЕВНР, ГВВМР, ГЕВМР.В качестве источников углерода в среде культивирования используютуглеводы или спирты , или органические кислоты.Из углеводов используют глюкозу,Фруктозу, мальтозу, сахарозу, крахмал, гидролизованный крахмал и мелас.су. Из органических кислот используют уксусную, пропионовую, бензой- " 5ную или Фумаровую кислоты, а изспиртов - метанол, пропанол илиэтанол.Среда может содержать несколькоисточников углерода. Некоторые мутанты ассимилируют углеводородыв качестве основного или второстепенного источника углерода.В качестве источников азота применяют соли аммония, нитраты, нарбамиды, аминокислоты и жидкости, получаемые после вымачивания кукурузы,дрожжевой. экстракт, мясной экстракт,рыбнуюмуку, пептон, бульон, продукты гидролиза казеина и их смеси, а 20также аммиак.Необходимые неорганические ионыотмачивают сульфатом магния, Фосфатом магния, первичным кислым фосфорнокислым калием, сульфатом железа, 5хлоридом марганца, хлоридом кальция,хлоридом натрия и т.п.Антибиотики выбирают из группыхлорамфеникол, казугамицин, тетрациклин, экситетрациклин, эритромицин,диоксистрептомицин митомицин "С",антиномицин Ъ", циклозерин, соединение группы пенициллина, цефалоспорина, полимиксин и аэосерин.Из поверхностно-активных веществв среду вводят сульфат высшего спирта; алкилбензосульфонат; алкилфосфати диалкил-сульфосукцинат; катионныевещества, например соли алкиламина ичетвертичные аммониевые соли; неионные вещества, например алкильный 40простой эфир полгокталкилена,моноалкильный простой эфир полиоктэтиленсорбитана и сорбитан монолаурат;амфотерные вещества, как имидазолини бетаин. 45Из антиокислителей в среду вводят4,4-диокси-З,З-диметилдифенил; 2,6-ди-З-бутилфенол, катехол, бутилкатехол, протокатеховую кислоту, М "-токоферол, пирогаллал, галловую кис- олоту, сложный эфир галловой кислоты,нафтол;фенольные соединения, напримерамфинофенол, амины, например нафтиламин, дифениламин, ди-бутил-Ь-Фенилендиамин, б-этокси,3,4-триметил,2-дигидрохинолин, семикарбазид,фенотиазин и тетрафенилгидразин; соединение, содержащее серу, напримертио-дипропионо ая и тио-дигликолевая кислота,Водородный показатель рН ферментационной среды контролируют и поддерживают на уровне, необходимом дляоптимального получения Е-лизина, преимущественно в пределах от 5,0 до9,0, добавлением карбамида., ающака,углекислого кальция, органических и неорганических кислот в процессе ферментации.Ферментацию осуществляют при температуре 24-37 аС, значение которой зависит от культивируемого микроорганизма, при аэробных условиях в течение 2-7 дней.-лизин извлекают из жидкой среды (бульона) одним из известных способов, например путем адсорбции на подходящих ионообменных смолах, с последующим отмыванием, удалением клеточного Материала и концентрированием Фильтрата, содержащего -лизин. С-лизин идентифицируют по его мингидринной реакции на бумажной хроматограмме, по значению показателя"ЯГ" на бумажной хроматограмме, подаьным электрофореза, качественногомикробиологического определения ипо реакции с декарбоксилизой лизина,а также по результатам, получаемымпри применении тождественных образцов,Количество -лизина, выработанного в составе бульонной культуры, определяют калориметрическим методом,основанным на кислотной медной,нингидринной реакции.Получаемые результаты относятсяк солянокислому производствуП р и м е р 1. Готовят питательную среду для культивирования следующего состава,Ъ: глюкоза 10; сернокслый аммоний 4,5; первичный кислыйфосфорнокислый калий 0,1, семиводный сернокислый магний 0,04; катиондвухвалентного железа 2 млн катиондвухвалентного марганца 2 млн ; биотин 50 мг/л; хлористоводородная сольтиамина 200 мг/л; продукт гидролизасоевого протеина (общее содержаниеазота 7) 1; углекислый кальций(стерилизован отдельно) 5. Устанавливают рН 8,0 и делят на порции по20 мл. К каждой порции добавляютхлорамфеникол или "Мирамол 2 МСА(торговое наименование катионногоповерхностно-активного вещества),в указанных ниже количествах добавляют в колбы по 500 мл, перемешиваютвстряхиванием и стерилизуют.Отмеренные порции инокулируют,соответственно ВгечЬасйегцв 1 асо 1 егвепйцв - 1944 (штамм, устойчивыйк действию "АЕС", полученный искусственным путем из ВгечЬасегцв1 асйоГегвепйцв АТСС 13869 и СогупеЬассег 1 цв д)цйавсцв РЕЯМР(штамм, устойчивый к действию "АЕС,"полученный искусственным путем изИсгососсць 91 цавсць АТСС 13032),которые предварительно культивируютна косых желатиновых средах на бульоне, содержащем глюкозу. Культивирование проводят при 31 оС и встряхивании.Затем отмеренные порции делят надве группы порций,-лимеютноа чер ия.Кул ество ульон э 15 ч ученияспособдобавлначалеэритроми лиобавлене добавлен ГЕВМР1944 3,1 К одной группе порций добавляютхлорамфекол сразу или через 15 ч,считая от момента инокулироваия, в Примечаниебавления, пс сравнениюопределяют оптическуюИз ферментационных бульонов,которых культивируют оба штаммасреде, к которой не добавляют анбиотики, отбирают более 300 колодля каждого и исследуют на спосность вырабатывания -лизина. Прэтом устанавливают, что все ониобладают устойчивостью к "АБСИД,служит доказательством пригодносштамма для выработки 1.-лизина. Э П р и м е р 2. Для по ина проводят ферментаци писанным в примере 1, нколичествах, указанных в табл. 1.Процесс фермектации проводят72 ч,оТаблица 1 после 26-кратного разачальным объемомпри 562 тмсвидетельствует также обявления, обратной мутацинения мутанного штамма д72 ч культивирования. К другой группе порций до Миранол 2 МСА" (торговое наи ие) сразу или через 7 ч пос ирования в количествах, при ых в табл. 2.Табл ц а 2 осле инокулировативируют 82 ч,при этом 1.-лизина, накопившегосяприведено в табл. 3.Таблица 3759056 Наименование штамма Добавле ние зри рсмкцин акопление,2 СогупеЬассег 1 цв .91 цащсцщ РЕВМР .1613 1. 2,2,5 П р и м е р 3. Ферментацию водят способом, описанным в примере 1, но добавляют продукт "Твен" (торговое наименование П р и. м е р 4. Ферментацию проводят, как описанов примере 1, применяя штаммы Вгеч 1 Ьасйегцщ 1 асйоГегщепсцщ ГЕЙМР(обладает устой чивостью к АЕСф и потребностью в аланине), СогупеЬасег 1 цщ 91 цйащсцщ ГЕ 11 МР(обладает устойчивостью 4 к "АЕС". и потребностью в серине), СогупеЬасгег 1 цщ 91 цйащ 1 сцщ ГЕКМР(обладает устойчивостью к "АЕС" и потребностью в пролине), Вгеч 1 Ьасг.ег 1 цщ 1 ас 1 оЕегщепцщ ГЕВМР(обла Продолжение таблицы 3 полиоксиалкиленовых сорбитан-монолауратаКультивируют 72 ч накопившегося в буль приведено в табл, 4. дает устойчивостью к "АЕС" и потребностью в аланине и лейцине), Вгеч 1 Ьасйег 1 цщ 1 ас 1 оГегщепцщ ГЕДИР759056 Пеницилин,ед/мл:вначале - 1,0 ед/млчерез 24 ч5,0 ед/млбез добавления Согуп еЬассег 1 цщ91 цсав 1 сцв РЕВМР -1982 0,93 3,3 1,02 3,0 Вгеч 1 Ьассег 1 цв1 асСойегщепСцщГЕВМР.О, 1без добавления 3,6 3,1 П р и м е р 5. Ферментацию проводят, как описано в примере 1, используя штаммы СогупеЬассегцщд 1 цсав 1 сцв ГЕВМР; СогупеЪассег 1 цв д 1 цсащ 1 сцщ ГЕВИР"1982; Мсгосос- ЗО сц 5 д 1 цСав 1 сц 5 АТСС 13286 (обладает потребностью в гомоозерине); Вгеч 1- Ьассег)цв 1 ассОЕегщепсцв, ГЕВМР(обладает устойчивостью к "АЕС" и потребностью в серине совместно с лейцином); Вгеч 1 Ьассег 1 цщ 1 ассоГегщепсцв.ГЕВМР, Вгеч 1 Ьассег 1 цщ 1 ассоЕегПродолжение таблицы 5 вепсцв ГЕВМРи Вгеч 1 Ьассег 1 цщ1 асСОГегщепСцщ ГЕВМР. Добавляют также питательные вещества, поверхностно-активные вещества, соответственно, после 16 ч культивирования. Культивируют 72 ч. Количество на,копившегося в бульоне 1.-лизина приведено в табл. 6.-150 2,3 П р и м е ч а н и е. Рипон 1.Е 110 - этаноламнновая соль алкилбензолсульфокнслоты; Рипонол ЬЬ 103 - лаурия сульфат, Рипомин 1.Н " аифотерные поверхностно-активные вещества типа имидазолина; Рипонокс ИСК - простой алкильный фенольный эфир полиоксиэтилена; Ованол 516 - амотерное поверхностно-активное вещество типа бетаина; Катионал НТВ - бензолконийхлоридНиссаннонион 1.Т 221 - неионное поверхностно- активное вещество,Таблиц а 7 Вгеч 1 Ьасйег 1 цщ1 асйоГегщепйцщГЕВИР2 1 гечЬасйег 1 цасйоГегщепФцЕВИР5 4 ения Тио-дигликоль:через 12 ч - 0,0без добавления Вгеч 1 Ьасйег 1 цщ1 асйоУегщепйцвГЕ ВМР5,4 1.-токоферол:через 12 ч - 0без добавления Вгеч 1 Ьасйег 1 цщ 1 асйоИгщепйцщ ГЕ ВИР3,7 3,1 Бутилок(БНД):через 1без доб иакизол ВгечЬассег 1 цасйо 1 егщепФцГЕ ВИР,4 чления Гипоксант техол: 2 ч-О, авления утилк Вгеч 1 Ьасйег 1 цщ 1 асйоГегщепйцщ ГЕВМР -18411.-ме150 ч н з д техов ая СогупеЬасйег 1 цвд 1 цйавсцщГЕ ВМР1,0влен 1,8 П р и м е р 6, Процесс получения 1.-лизина проводят, как описано в примере 1, но в качестве микроорганизмов используют атаевы Вгеч 1 Ьасйег 1 цщ 1 асвоФегщепйцщ ГЕВИР, ГЕВИР, ГЕВИР, ГЕВИР, ГЕВИР, ГЕВМР, СогупеЬасег 1 цщ дцйащ 1 сце ГЕВИР"1987,ГЕВМР,ГЕВИРи М 1 сгососсць д 1 цйав 1 сц АТСС.В среду добавляют питательные вещества, необходимыев некоторых случаях, и антиоксйданты.Культивируют 72 ч.Количество накопленного 1.-лизина приведено в табл, 7. Галловая кислота вначале - 0,5 без добавлениятновая кис- аурилгал-аспара759056 14 Продолжение табл. 7 СогупеЬасг.ег 1 цв91 ОФдв 1 сцвРЕ ВМРВгеч 1 Ьас е г 1 цв1 дсйо 1 егвеп ГцвГЕ РМРВНА и тио-дигликолевая кислота:через 12 ч - 0,02и 0,1 соответственнобеэ добавления 3,8 3,0 М 1 сгососсць91 цгдв 1 СО 5АТСС 13286 Зтилгаллат: через 12 ч - 0,1 О-метионин,0 беэ добавления 4,4 3,8 помещают в 500 мл колбу, перемешивают встряхиванием и :терилиэуют.Затем отмеренные порции инокулируют штаммом Вгеч 1 ЪасСег 1 цп 1 1 асйоГегвепцв РЕВМР, культивированную ранее на косых желатиновых средах на бульоне, содержащем глюкозу.ЗО Культивируют при 31 С 72 ч привстряхивании и добавлении к среда хлорамфеникола, эритромицина, "Миранола 2 МСА" и/или "Твена 20".Количество накопленного 1.-лизина 35 приведено в табл. 8. Таблица 8 4,3 25,0 мг/мп15,0 мг/мл 0,1ХлорамфениколЭритромицинМиранол 2 МСАТвен 20 4,1 3,9 1818 3,8 0,2 4,6 17 Контроль(отсутствие) 3,5 П Р и м е Р 8. ВгдчЬасйег 1 цв1 асйо 1 егвепйцв РЕЙМРкультивируют, как в примере 7, но применяют содержащую 15 свекольноймелассы (в пересчете на глюкозу),а 0,1 фМиранола 2 МСА" добавляютчерез 26 ч после инокулирования, 46Культивируют 90 ч, при этом накопление в бульоне 1.-лизина равно5,8 г/дл. При культивировании без"Миранола 2 МСАф накопление 1.-лизинаравно 5,2 г/дл,П р и м е р 7. Готовят питательнуюсреду для культивирования при рН 8,0,содержащую компоненты, : свекольнаямеласса (в пересчете на глюкозу) 10;сернокислый аммоний 4,5; первичныйкислый фосфорнокислый калий 0,1:М 9504 7 Н ъО 0,04; продукт гидролизаосевого протеина (общее содержаниеазота - 7) 1,5;углекислый кальций5,0;катионы двухвалетного железа идвухвалетного марганца по 2 млн ;биотин 50 мг/л и хлористоводороднаясоль тиамина 200 мг/л.Среду делят наотдельные порции по 20 мл и каждую Хлорамфечикол 25 мг/мли Твен 20 0,2 Бутилокситолуол:через 12 ч - 0,05 3,3 беэ добавления 3,0 П р и м е р 9. СогупеЬдсйег 1 цв 91 цйав 1 сцв РЕВМРкультивируют, как в примере 7, но применяют патоку тростниково-сахарного производства вместо свекольной мелассы н к среде добавляют тетрациклин, "Ниссаннонион Т 221 ф или галловую кгслоту. Культивируют 72 ч. Количество накопленного Ь-лизина в бульоне приведено в табл. 9.(отсутствие) 3,1 Формула изобретения Составитель А. БражниковаТехред А; Щенанская Корректор В. Синицкая Редактор Т. В 1 агова Заказ 5664/53 Тираж 522 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5филиал ЛПП фПатентф, г. ужгород, ул. Проектная, 4 Способ получения 1.-лизина путем культивирования продуцирующих его микроорганизмов рода СогупеЬасйегов или Вгеч 1 Ьасйег 1 ов на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, необходимые минеральные соли в присутствии антибиотиков, или оверхностно-активных веществ, нли нтиокислителей, с последующим выделением целевого продукта, о т л и ч а и щ и й с я тем, что, с целью повышения выхода лизина, из рода СогупеЬасйег 1 цв или Вгеч 1 Ьасйег 1 ов используют штаммы СогупеЬасйег 1 шп 94 цйав 1 сцв ГЕКМР, ГЕВМР, ГЕ 11 МРили Вгеч 1 Ьасйег 1 цв 1 асйоГе гвеп 1 ов ГЕ йМР, ГЕ 11 МР,ГЕ ИМР, ГЕВМР, ГЕВМР,Щ ГЕВМР, ГЕЯМР, при этомкультивирование ведут на среде,содержащей в качестве источника углерода углеводы или спирты, или органические кислоты, в присутствии антибиотиков, выбранных из группы: хлорамфеникол, эритромицин, диоксистрептомицин, тетрациклин, или поверхностноактивных веществ, или антиокислителейв количествах, соответственно равных3,5-25 мг/мя, 0,05-2 и 0,051,0 мг/мп,Источники инФормации,принятые во внимание при экспертизе1. Патент Франции 9 2050080,кл. С 12 0 13/00, опублик. 1971.