Способ получения -лизина

СОЮЭ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУЬЛИН 2 Р НОМИТЕТ СССР ТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙОСУДАРСТ 8 ЕНН ПО ДЕЛАМ ИЗО ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНН АВТОРСКОМ,Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ инизина.опром.(71) Белорусский ордена ТрудовогоКрасного Знамени технологическийститут им. С.М.Кирова(56) 1Способ подпитки в процеферментации при производстве лПроспект ВДНХ СССР ГлавмикробиОНТИТЗИ - Микробиопром, 1981,2. Авторское свидетельство СССРВ 498940, кл. А 23 К 1/00, 1973.3. Авторское свидетельство СССРВ 675980, кл. С 12 Р 13/08, 1979.(54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ. Ь-ЛИЗИНА,включающий глубинное культивированиепродуцирующих его микроорганизмовна питательной среде, содержащей ис-.точники углерода, минеральные соли,ростовые аминокислоты, в условияхаэрации при периодическом добавлении питательной среды в процессекультивирования с последующим выделением лизина из культуральнойжидкости, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что, с целью повышения концентрации лизина в культуральной жидкости при одновременном сокращениипродолжительности биосинтеза лизина,питательную среду добавляют при оста.точном содержании треонина в среде0,03-0,08 г/л,Изобретение относится к микробиологической промьпипенности, вчастности к получению незаменимойаминокислоты Ь-лизина, используемойв качестве добавки к кормам пля 5животных и птицы.Известны способы получения Ь-лизина путем глубинного культивирования продуцирующих его микроорганизмов на питательной среде, содержащей источники углерода, минеральные соли и необходимые аминокислоты, при периодическом добавлениив процессе культивирования питательной среды, содержащей источники 15треонина, метионина и других необходимых при биосинтезе лизина веществс последующим выделением Ь-лиэинаиз культаральной жидкости. Время начала добавления дополнительных питательных веществ (подпитки), необходимых для роста биомассы и биосинтеэа Ь-лизина, определяют по отклонению от необходимого уровня рНкультуральной среды 11, концентрации редуцирующих веществ 23 и рядудругих показателей,Однако эти способы не обеспечивают стабильность процесса биосинтеза Ь-лизина вследствие того, чтоуказанные показатели не учитываютсодержание компонентов, определяющих биосинтетическую активностьЬ-лизина, ростовых аминокислот соФдержание которых значительно колеблется в различных источниках сырья.35Наиболее близким к предлагаемомуявляется способ получения Ь-лизинапутем глубинного культивирования егопродуцентов на питательной средеэ 40содержащей источники углерода, минеральные соли, ростовые аминокислоты,в условиях аэрации при периодическом добавлении питательной среды впроцессе культивирования (стериль 45ных водных растворов мелассы и мочевины), причем раствор мелассы вносятпри снижении РВ в культуральной жидкости по 4,0 " 7,5 7 и раствор мочевины - начиная с 24-го часа культивирования М .50Однако известный способ не обеспечивает стабильных показателей прибиосинтезе Ь-лизина и они колеблютсяв широких пределах (уровень накоппения лизина 46"75 г/л в течение72-96 ч). Это связано с тем, чтоауксотрофные мутанты - продуценты лизина, лишь при наличии ростовых аминокислот в среде активно растут и при их утилизации рост культуры прекращается и начинается синтез лизина. Если в периоп прекращения роста культуры и начала активного синтеза внести в среду какой-либо источник ростовых аминокислот, то культура начнет перестраиваться на синтез биомассы, а это связано с торможением биосинтетических процессов, Таким образом, способ полачи в ферментационную среду, например, раствора мелассы, содержащей нарялу с углеводами ростовые аминокислоты, при определенной концентрации в среде редупирующих веществ (углеводов) не обеспечивает стабильных показателей прибиосинтеэе лизина. Пель изобретения - повышение концентрации лизина в культуральной жидкости при одновременном сокращении продолжительности биосинтеэа.Поставленная цель достигается тем, что согласно способу полученияЬ-лизина, включающему глубинное культивировапие продуцирующих его микроорганизмов на питательной среде, содержащей источники углерода; минеральные соли, ростовые аминокислоты, в условиях аэрации при периодическом добавлении питательной среды в процессе культивирования с последующим выделением лизина иэ культуральной жидкости, питательную среду добавляют при остаточном содержании треонина в среде 0,03-0,08 г/лАктивный синтез лизина начинается после утилизации значительной части ростовых аминокислот и, в частности, треонина. Причем максимальная скорость биосинтеза лизина достигается при сравнительно низкой удельной скорости роста культуры, которая зависит от остаточного содержания ростовых аминокислот в среде, В случае же полной утилизации ростовых аминокислот удельная скорость роста культуры приближается к нулю и скорость биосинтеза лизина при этом снижается, Максимальная скорость биосинтез лизина соответствует невысокой концентрации ростовых аминокислот и, в частности, треонина в пределах 0,03-0,08 г/л. Таким образом, начало внесения подпитки, содержащей наряду с углевоцами ростовые аминокислоты, обеспечивает высокие показатели при бпосинтеэе лиэина. При известном же способе началоподачи подпитки в зависимости отконцентрации углеводов в среде непредставляется возможным по отмеченным причинам, Невозможно также получить стабильные показатели биосинте, 25 0,08-0,120,8-1,0 При достижении уровня треонинавсреде 30-80 мг/л начинают произвоза лизина.Способ осуще.ствляется следующимобразом,ПродуцирующиеЬ-лизин гомосерин- Фзависящие микроорганизмы выращиваютв лабораторных условиях в колбах накачалке, а затем в посевном ферментере емкостью 1 мз при непрерывнойчаэрации и перемешиванни при 30-32 С, 15рН 7,0-7,4 в течение 14-24 ч с использованием питательной среды следующего состава, г/л;Меласса (с концентра-цией РВ 46-487) 80-100 20Ь- Треонин (источником является гидролизат БВК и меласса) 0,14-0,181.-Метионин (источником является гидролизат БВК) 0,04-0,06ИНС (источникомявляется нейтролизат БВК) 8-9ИННр РО Оф 04 Оф 06 ЗоМел технический 8-10Пропинол БО, 15-0,2Для биосинтеза 2-лизина посевнойматериал с концентрацией биомассы9-11 г/л в.количестве 0 4-0 5 м пе 3 Э 5редают в ферментер емкостью 15 м ипроводят ферментацию в аэробных условиях при расходе воздуха 0,71,2 м /мин на 1 мз среды при 3032 С, рН среды 7,2-7,6 на питательной среде следующего состава, г/л:Меласса (по РВ 46-487) 135-140Ь-Треонин (источникомявляется гидролизатБВК и меласса) 0,26-0,32Ь-Метионин (источником является гидролизат БВК)НН,Н,РО,ИНС 1 (источникомявляется нейтроли 50зат БВК) 16-20Мел технический 5-8Пропинол БО, 15-0, 20Начальный коэффициент заполненияферментера 35-437.50,045 дить подачу дополнительной питательной среды по 300-400 л через каждые 2-3 ч следующего состава, г/л:Меласса (с концентрацией РВ 46-487) 500-600Ь-Треонин (источником является меласса и гидролизат БВК) 0,20-0,22Ь-Метионин (источником является гидролизат БВК) О, 08-0, 12ИН,Н,РО, 0,8-1,0НН,С 1 20-25Пропинол Б0,15-0,20Подачу питательной среды заканчивают при коэффициенте заполнения ферментера 0,7-0,8,В процессе подпитки концентрацию РВ в ферментационной среде поддерживают 3-5 Х, а биомассы 18-22 г/л. По окончании процесса ферментации культуральную жидкость стабилизируют, затем упаривают и высушивают до влажности 8-107.ПримерПродуцент Ь-лизина СогупеЬасегдцш 81 цйаппсцв Твыращивают сначала на агаризированной питательной среде, а затем в колбах (750 мл) на качалке (250 об/мин) при 30-32 С в 50 мл питательной среды следующего состава, г/л:Меласса (с концентрацией РВ 463) 8Ь-Треонин (источником является гидролизат БВК и меласса) 0,15Ь-Метионин (источником является гидролизат БВК) 0,045ЮНС 1 (источником является чейтролизатБВК) 8ИННРО 0,6Мел технический 8Пропинол Б0,15Затем выращивание 0,5 м посевного материала продолжают в посевном ферментере емкостью 1 м с использованием питательной среды следующего состава, г/л:Меласса (с концентрацией РВ 467) 8Ь-Треонин (источником является гидролизат БВК и меласса) 0,151;Метионин (источником является гпдролизат БВК)135 17 ЮНС 1 (источником является нейтролизатБВК) 8НН 4,НРО 4. О, 6Мел технический 8 5Пропинол Б0,2В процессе получения посевного материала в ферментере поддерживают расход воздуха 1 м /мин на 1 м среды, рН среды 7,0, температура сре ды 30 С, Полученный посевной материал с концентрацией биомассы 9 г/л в количестве 0,5 м передают в ферментер емкостью 15 м, в котором проводят основную ферментацию., 15Исходный состав питательной среды в ферментере (с учетом компонентов посевного материала) следующий, г/л:Меласса (с полдержа" 20нием 46 Х РВ)Ь-Треонин (источником является гидро"лизат БВК и меласса) 0,28Ь-Метионин (источником является гидролизат БВК) 0,09ЯННРО 1ЯН 4,С 1 (источникомявляется нейтролизат БВК) Мел .технический 5Пропинол Б0,2Начальный коэффициент заполненияферментера (с учетом посевного материала) 0,433, В начале процессаферментации поллерживают расходвоздуха 0,7 м /мин на 1 и среды,рН среды 7,2, температура среды30 С. По истечении 10 ч ферментациирасход воздуха увеличивают до1,2 м /мин на 1 мэ среды и поддерживают рН 7,4.После внесения посевного материаФла отбирают пробу из ферментера иопределяют начальную концентрациютреонина методом газожидкостнойхроматографии, которая равна300 мг/л. По истечении 6 ч от начала культивирования определяютостаточное содержание треонина вкультуральной жидкости, которое равно 150 мг/л, Затем по предварительно построенной табл. 1, отражающейпотребление треонина продуцентом лизина в данных условиях культивирования, исходя из остаточного содержания треонина, определяют время, прикотором остаточная концентрация треонина в ферментационной среде достигнет 0,06 г/л, Это время равно9 ч,1 (б х Е о х хЭЦ оЭ Эа ао ьож хох ох сО Э Б 3 й о Щ ,Ол сО о о л о 1о 3 м Ц Ю Ф о Л о ф о л Ю 11 о с 3I Среднее 46,2 48,0 46,7 47,1 69 66 69 1.0 45,5 66 44,5 9 115705Через 9 ч после начала ферментации начинают подавать подпитку по 300 л через каждые 2 ч следующего состава, г/л:Иеласса (с концентра 5цией РВ 46%) 543Ь-Треонин (источником является меласса и гидролизатБВК) 10Ь-Иетионин (источником является гидролизат БВК) 0,08ХН Н Р 04. 1ИН,С 1 25 15Пропинол Б0,2В процессе подпитки концентрацию РВ в ферментационной среде поддерхд- вают 3,5%. Подача подпитки обеспечивает поддержание биомассы на уров не 18 г/л. При достижении коэффициента заполнения ферментера 0,7 подачу подпитки прекращают и в среду вносят 1 г тиамина и 0,5 г дистибиотина. К 55-му числу ферментации в 25 культуральной жидкости накапливается Ь-лизина на уровне 48,5 г/л, что составляет 37,2% от потребленного сахара, Культуральную жидкость стабилизируют добавлением соляной кисло-З 0 ты до рН 4,5 и 0,2%-ным бисульфитом натрия, затем упаривают, смешивают и высушивают до влажности 8%.П р и м е р 2, Посевной материал продуцента Ь-лизина ВгечгЬасгегдцщ Г 1 асщщ выращивают как в примере 1, . Биосинтез Ь-лизина проводят в условиях анапогичных примеру 1.Концентрация Ь-треонина в ферментационной жидкости перед началом ферментации равна 0,28 г/л, Через 8 ч от начала ферментации остаточное содержание треонина в ферментационной жидкости достигает уровня О, 14 г/л. По табл. 1 по известным концентрациям треонина 0,28 и О, 14 г/л находят время, при котором концентрация треонина в ферментационной жидкости равна 0,08 г/л. это время равно 11 ч от начала процесса Ферментацчи, Через 11 ч начинают по 50 дачу подпитки состава, указанного в примере 1. К 67-му часу ферментации в культуральной жидкости накапливается 5 Ь-лизина на уровне 48 г/л, что со,ставляет 38,7% от потребленного сахара. П р и м е р 3. Выращивание посевного материала и биосинтез лизина проводят согласно примеру 1. При этом начальное содержание треонина в культуральной жидкости при биосин" тезе лизина равно 0,32 г/л. После 6 ч ферментации содержание треонина равно 0,17 г/л, Согласно табл. 1 начало подачи подпитки проводят через 10 ч, когда остаточная концентрация треонина достигает 0,03 г/л.К 56-му часу ферментации в культуральной жидкости накапливается Ь-лизина на уровне 47 г/л, что составляет 35,7% от потребленного сахара.В табл. 2 представлены показатели при биосинтеэе лизина серии операций, проведенных согласно предлагаемому способу. СогупеЬасгеггцщ 81 цГащ.сцщ Вгеч 1 Ьасгег 1 цщ Г 1 ачцщ Е157059 Среднее 66 46,7 Составитель О,СкородумоваТехред П,Микеш Корректор Г,Решетник Редактор Н.Яцола Заказ 3282/23 Тираж 525 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 13035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул, Проектная, 4 Из табл. 2 видно, что накопление лизина в культуральной жидкости происходит до концентрации 44,2 - 48 г/л за время 53-58 ч продуцентом лизина СогжоЬасгегцщ я 1 цСатдсцщ Т-З и до концентрации 44,5-48,2 г/л за 64-68 ч продуцентом Вгеч 1 Ъасгег 1- щп Г 1 ащип Е. За время культивирования достигается высокий стабильный выход лизина по сравнению с известным способом, использование которого в промышленных условиях, например, на Пебекинском биохимическомзаводе, дает выход лизина 25-357.Предлагаемый способ по сравнениюс известным позволяет обеспечить воспроизводимость высоких показателейпри биосинтезе лизина: концентрациилизина в культуральной жидкости44,2-48, г/л ,при использовании культуры Ти 44,5-48,5 г/л - для куль- О туры Е, время биосинтеза 55-58 чдля культуры Ти 64-69 ч - длякультуры Е. По сравнению с базовым объектом, используемым на Ливанском .биохимическом заводе, выход лизина от потребленного сахара увеличился с 32- 34 до 35-382, койценрации лизина в культуральной жидкости выросла от 37-39 до 44-48 г/л, время ферментации сократилось от 70-75 до 64- 69 ч прн использовании культуры Е.