Способ получения аминокислот

В.И, Сухаревич, В.А. Лазеба, В З.И. Зайцева, И.И. Шильнико И. Яковлев,Ъ. а и А.И. Луйин Г . ебабов,72) Авторы изобретения й Революцйи и ологический и ий ордена Октябрьс расного Знамени теим. Ленсовета енинград рудового рдена.,титут 7 ) Завввтел ПОСОБ ПОЛУ 4 ЕНИЯ АМИНОКИСЛОТ Известны такие спмикроорганизмов на идах, по которым с цеции процесса выращивв качестве биостимуллекулярные кислотыщелочного окислениямодийицированного коГчестве 0,0001"0,013кислоты в количестве12 и 3. л Недостатком укаэанных способов является то, что, например, исполь" эование сланцевых кислот предуснатри" вает выделение их из водно-щелочного оксидата с помощью специального метода на угле СКТ при 200 С. Такое вы-деление сопряжено со значительными потерями монокарбоновых кислот, в ре" зультате чего количественное и относи" тельное содержине моно- и дикарбоновых кислот существенно отличается от содержания их в водно-щелочном оксиИзвес дусма честве рсодериае Изобретение относится к микробиоогической промыщленности, а именно к способам получения аминокислот.Известные микробиологические способы получения различных аминокислот, в частности лизина, гомосерина5 и т.д., предусматривают глубинное культивирование специальных мутантных ытаммов из родов СогчпеЬасйег 1 цп и Вгеч 1 Ьасйегач на йерментационнцх питательных средах, содержащих ассимилируемые источники углерода (углеводы, ацетат, зтанол, углеводороды), источники азота (сульфаты или хлориды аммония, мочевина), соли йосбюра или магния, микроэлементы (марганец, цинк, железо) и источники необходимых ростовых факторов (витамины, аминокислоты) . н способ получения лизина,ивающий использование в катового (фактора гомосерин"культуральной жидкости 1 собы выращивани тательных среью интенсибикания используют яторов внсокомо" продукты водноерогена сланца, альтом, в коли" ли сланцевые 0,0002 Б"0,004 Р3 9758дате (ВЩО). Применение, например,сланцевых кислот при биосинтезе ли"зина не оказывает стимулирующего действия на этот процесс.Наиболее близким к предлагаемомупо технической сущности и достигаемо"му эффекту является способ полученияаминокислот путем глубинного культивирования продуцирующих их микроорганизмов на питательной среде, содержа- Ощей источники углерода, азота, минеральные соли и стимулятор роста в виде лейцинсодержащей культуральной жид-,кости, получаемой при культивированиимутантного штамма Вгеч 1 Ьасйвг 1 цв Ьс-. 1отегвепйцн. При получении лизина поэтому способу используют мутантныештамиы различных глутаматпродуцирующих бактерий из родов СогупеЬасйег 1 цеи Вгеч 1 Ьасйег 1 цп 4.Добавление лейцинсодвржащей культуральной жидкости 1 повышает выход лизи"на на 20-25/ и соответственно увеличивает коэбхициент конверсии. Иеханизмдействия этого стимулятора неясен. До 15бавление в среду чистого лейцина иликультуральной жидкости штамма " продуцента глутаминовой кислоты подобного стимулирующего эМекта не дает, Реа.лизация способа связана с получением зфспециальных лейцинпро 4 уцирующих штам"мов у Вгеч 1 Ьасйег 1 цв 1 асйоегвепйцщ,их предварительным культивированием,что существенно удорожает способ.Цель изобретения - увеличение вы"хода аминокислот.Поставленная цель достигается темичто по способу получения аминокислот, предусматривающему глубинноекультивирование мутантных штаммовпродуцентов на жидкой .питательнойсреде, содержащей ассимилируемые источники углерода, азота, минеральныесоли и стимулятор роста, в условияхаэрации среды с последующим выделением целевых продуктов, в качествестимулятора роста используют водно-щелочной оксидат керогена сланца в ко". личестве 5-101 от объема среды.Оксидат получают известным методом - путем окисления керогена кисло"родом воздуха в водно-щелочной средепри 200 С, давлении 30-40 атм в тече"ние 3-4 ч, Неокисленный остаток от"деляют от оксидата простым Фильтро"ванием,П р и м е р 1. Односуточную культу.ру мутантаСогупеЬасйег 1 цв д 1 цйап 1 сцщ95, выращенную на косяках с агаромХоттингера, пересевают на жидкую посевную среду следующего состава, Ф:меласса 4,0; кукурузный экстракт 3;йаГ 2 0,4.Посевной материал выращивают в течение 16"24 ч в колбах на качалке при28-304 С и затем в количестве 5 об.Фпереводят в ферментационную среду,содержащую,Сахар (сырец), Ж 10(МН) 50, Ж 2,0КНРО а 0,10 Оксидат имеет следующий групповойсоставГ/л: 00 4Неорганические ве"щества 185 0Органические вещества 29,0Органические кислоты 235Ионокарбоновые кислоты - от уксус" ной до капроновой, дикарбоновые " от янтарной до себациновой.Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.В качестве продуцентов лизина и гомосерина используют соответственно гомосерин и треонинэависимые мутанты СогупеЬасйег 1 цг и Вгеч 1 Ьасйег 1 вч, например СогупеЬасйег 1 ци д 1 цйап 1 сцн 95 или Вгеч 1 Ьасйег 1 цщ зр 22 Л. Культуру указанных штаммов, выращенную на агаризованной питательной среде Хоттингера, переносят в колбы с посевной средой и выращивают при постоянной аэрации и перемешивании в течение ,14"20 ч при 29+1,0 С. Затем посевной, материал в количестве 1-5 об.4 переда" ют в ферментационную среду. Процесс биосинтеза осуществляют при интенсивной аэрации и перемешивании при 30- 32 С и рН 6,8-7,6, Продолжительность ферментации 64-60 ч. 8 состав Ферментационной среды, помимо известных компонентов источников углерода (сахар, меласса), источников азота (сульфат, хлорид), источников ростовых факторов (кукурузный экстракт или гомосеринсодержащая культуральная жидкость добавляют в количестве 5-10 об.7, спе" цифический субстрат - водно-щелочной оксидат (8 ЦО), получаемый, как указывалось, при водно-щелочном окислении керогена ВЯО.После окончания процесса лизин получают в виде технического продукта- кормового концентрата или в виде кристаллов одним из известных способов.975800 4Выращивание проводят в колбах Эрленмейера объемом 250 мл при объемеФерментационной среды 10 или 30 мл ив пробирках объемом 50 мп, содержа- % щих 2 и М мл среды при 28-30 С. Через72 ч в культурапьной жидкости накапливается продукт, количество которогодано в табл. 2.Таблица 2 Гомосерин риан Объем ВЦО,среды об.Ф/л онт- олю(контль 1 10 8 9)7 10 10 32,7 9,7 100 33,0 8,8 100 8 1 О9 (контроль 20 ЩО, об. Выход лизин Сахар10 20 11(контроль ) 3" 12 301236,Ь 100 10 Из, табл. 1 следует, что добавлениемВЩО в количестве 10 об.1 в среду с10 сахарозы увеличивает выход лизина на 113 по сравнению с контролем(без ВщО).,П р и и е р 2, Односуточную куль"этуру мутанта Вгеч 1 Ьасйег 1 цв Ю 1 ачцп 2,выраценную на косяках с агаром Хоттингера, пересевают на жидкую посевную среду следующего состава, Ф: меласс 3,0; кукурузный экстракт 3,0; 4 вМаС 0,1.Посевной материал выращивают в кол.бах на качалке при 28-30 С в течениеф18-21 ч и в количестве 5 об.Ф переда"ют в йерментационную среду, содержа эщую:Сахароза, Ж 10(0,5 г/л я расчете нагомосерин) 0,5Водно-щелочной оксидат, об,7. 10СаСО,1,0Выращивание проводят в колбах Эрленмейера объемом 250 мл при объеме среды 20 мл и 30-32 С. Через 68 ч в культуральной жидкости накап" ливается продукт, количество которого дано в табл. 1. Выделение лизина ведут одним из известных методов.Таблица 1 Из табл. 2 видно, что при высокой аэрации среды ВЦО практически не влиет на синтез гомосерина ВгечЬасйе" 1 цю Е 1 ауца. При низкой аэрации добав ление ВЩО к основной среде приводит к увеличению в 3 раза выхода гомосе" рина по сравнению с выходом в контрольных условиях (беэ ВЩО).П р и и е р 3. Отличается от при. мера 1 тем, что в качестве берментационной среды используют среду следующего состава:Иеласса, Ф (посахарч) 11Кчнурузный экстракт, 3 27 975800 8 Продолжение табл. 3 Ферментационную среду, составило 5; или 20 об.3,Результаты представлены в табл.4. Лизин ааааа иаиииаааа а лица11,0 20 О 30 Формула изобретения ВНИИПИ Заказ 8936/43 1 ираж 505 Подписное Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул, Проектная,Из табл. 3 следует, что при добавлении ВЩО и концентрации 10 об. в И Ферментационную среду выход лизина увеличился на 28 и 217:;, в зависимости от используемой культуры.При использовании культуры Вгеч 1" Ьасйег 1 нщ т 1 ачнщ выход лизина значи" зе тельно колеблется, в зависимости от интенсивности аэрации, и в условиях ухудшенной аэрации (30 мл среды) влияние ВЩО особенно эффективно и217. 3Это свойство ВЦО монет быть использовано для снижения расходов на аэрацию увеличения выхода и соответственно удешевления лизина при его 1 роизводстве.40При использовании другого продуцента, - СогупеЬасйег 1 нгГ 91 нйаю 1 сей 95 добавление 8110 в среду в условиях различной аэрации (10 и 30 мл среды или сульйитное число 3,2 и 1,2 20 г О /л ч соответственно) приводит к одинаково" . му увеличению выхода лизина на 67 по сравнению с выходом в контрольных условиях (беэ ВЩО),П р и м е р 4. Ферментацию Вгеч 1 Ьасйег 1,не эр 22 ЛД проводят в условиях примера 3. В отличие от примера 3, количество ВЦО, вносимого в Наибольший эффект был получен при введении в среду 1 О об.Ф ВЩО.Таким образом, предлагаемый способ позволяет увеличить выход амино" кислот на 67-3003 против 20-25 по известному. Способ получения аминокислот путем глубинного культивирования мутантных ытаммов - продуцентов на жидкойпитательной среде, содержащей ассимилируемые источники углерода, азота,минеральные соли и стимулятор роста,в условиях аэрации среды с последующим выделением целевых продуктов, ото т л и ч а ю щ и й с я тем, что,с целью увеличения выхода аминокислот, в качестве стимулятора роста используют водно-щелочной оксидат керогена сланца в количестве 5-10 отобъема среды.Источники ин 6 юрмации,принятые во внимание при экспертизе1, Авторское свидетельство ГССРЮ 675981,. кл. С 12 Э 13/06, 1977..2. Авторское свидетельство СССРЮ 653900, кл. С 12 В 3/14, 1977.3. Авторское свидетельство СССРй 875850, кл. С 12 Р 7/48, 1980.4. Патент США И 3952076,кл. 61-41, опублик. 1976.