Способ получения -лизина

ОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕ Н ИЯК ПАТЕНТУ Союз Советских Социалистических Республик(61) Доп ительный к патент Зая ено 26.04.73 (21) 1912978/1 Кл.2 Р 13/О(23) Приоритет - (3 27.04.72; 18.08.72;19,09.72; 30.11.72;ЗЗ) Япония Государственный комитет Совета Министров СССР по делам изооретений и открытий8.76.Бюллетень3 ия описания 15,12.7 5) Дата опубликова Иностранцыухико Есихара, Хаяо Хумихиро Есинага, Синд(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ Ь -ЛИЗИН относится к микробиологиенности, а именно к получес помощью микробной ферИзобретение кой промышл аминокис ментации.Известен способ получения (, -лизина путем выращивания продуцирующих его микроорганизмов, относящихся к одному из родов 3 ечЬос 1 еиню, ГоупеЬос 1 еиое, устойчивых к аналогам Ь -лизина, в питательной среде, содержащей усваиваемые источники углерода и азота, неорганические соли, необходимые питательные вещества и органические вещества, стимулирующие рост, при рН от 5 до 9 11.С целью упрощения процесса и повышения выхода 1, -лизина из родовБещЬас 1 ечце и СониеЬасебцю предложено использовать мутантные штаммы, обладающие наряду с устойчивостью к аналогам лизина потребностью по крайней мере в одном соединении, выбранном из группы, содержащей серии, пролин, алании, никотинамид,пантотеновую кислоту, тиамин, гуанин, гипаксантини витамин В, а именно из родайт еаЬас 1 Еиив используют вид 1 осМенпеиЬьтн штамм УАТСС 21798, АСАТСС 21799АДАТСС 21800, АДАТСС 21801,АУФЕРМ Р, АХ -3425 ФЕРМР, АХ -3429 ФЕРМ Р, А 1 -3391 ФЕРМ Р, АУФЕРМР, АХФЕРМ Р, АХ -Э 396 ФЕРМ Р, А 1 -3392 ФЕРМРили АХ -3393 ФЕРМ Р. Изрода Сом пеЬос 1 е иц е используют вид 1 тц 10 Ьисои штамм А 3 -3397 ФЕРМ Р,АХ -3458 ФЕРМ Р, АТ -3460 ФЕРМРили АТ -3461 ФЕРМ Р, видЙВцв штамм АУФЕРМ Р,ВИд ОСЕтОЭСЗОр 1 т 1 йцттт ШтаММ АЭ -3465и ФЕРМ Р,В качестве ассимилируемого источникауглерода можно использовать углеводы, уксусную кислоту, этанол, В качестве необходимых для роста веществ можно приме 2 О нять природные вещества.В качестве аналога Ь -лизина рекомендован Я -(2-амино)- 1. -цистеин (АЭЦ).Индекс ФЕРМ Р указывает на то, чтоштамм хранится в Исследовательском ин 25 ституте ферментации Управления приклад 526295ной науки и технологии Министерства торговли и промышленности Японии, откудаэтот штамм может быть получен,Мутанты, нуждающиеся в определенномпитательном веществе, были получены путем облучения исходного штамма рентгеновыми лучами или обработкой нитрозогуанидином и последующего выращивания колоний на твердой питательной среде при31 оС в течение 4-10 суток.19Питательная потребность выделенныхауксотрофных мутантов была определена известным способом,Мутации устойчивости к аналогу Ь -лизина были получены путем повторной обработки ауксотрофных мутантов нитрозогуанидином и выращивания их на синтетическойпитательной среде с добавлением аналога инеобходимого питательного вещества.Некоторые мутанты были получены путем первоначального получения мутации устойчивости к аналогу лизина и последующего введения мутации ауксотрофности,Преимушеством данного способа является получение нового типа мутантов, способ-,ных образовывать значительные количества. -лизина.Другим достоинством этого способа является отсутствие резкого влияния на биосинтез-лизина колебаний в содержании. -треонина так как штаммы устойчивы каналогам Ь -лизина,В качестве ферментационной среды можно использовать обычные среды, широкоприменяющиеся в производстве . -лизина.Необходимо только, чтобы в питательнойсреде присутствовали вещества, нужныедля роста мутанта. К числу таких веществотносятся аминокислоты серин, пролин, аланин, лейцин, различные витамины, например щвитамин В, , тиамин, пантотеновая кислота, никотинамид (или никотиновая кислота),пуриновые основания, например гуанин, аденин, шпоксантин, белковый гидролизат соевых бобов, дрожжевой экстракт, пептон, 45гидролизат казеина и др. Одним из важных факторов процессаферментации является содержание в средетребуемых аминокислот и других питательных веществ в количестве ниже того уровня, который является оптимальным для роста штамма.Ферментацию проводят при аэриоованиии перемешивании, в течение 24-96 часпри температуре 24-37 оС,рН среды поддерживают на уровне 5,09,0. Если рН среды в процессе ферментации становится меньше 5, то в среду добавляют мел или водный раствор аммиака.Если в качестве источника углерода используют органические кислоты, то рНимеет тенденцию к повышению и его доводят до необходимого уровня с помощьюкислот, например органической кислоты,которую используют в качестве источникауглерода, а также с помощью соляной илисерной кислоты.Ь -лизин выделяют из культуральной жидкости обычными методами. Бактериальные клетки могут быть отделены фильтрованием или центрифугированием, а лизин может быть извлечен с помощью катионнообменной смолы.Полученныйнизин идентифицируют с помощью бумажной хроматографии, методом электрофореза, микробиологическим методом или с помощью лизиндекарбоксилазы,П р и м е р 1, Готовят питательнуюсреду следующего состава: глюкоза - 10,0%,, фионы М - 0,2 мг %, тиамин солянокислый - 500 мкг/л, биотин - 50 мкг/л, белковый гидролизат соевых бобов (содержание азота 7%) - 15 мл/л и мел - 5%,рН среды 7,2,Среду разливают по 20 мл в качалочные колбы объемом 500 мл и стерилизуют,Колбы засевают штаммами, указаннымив табл. 1.526295 Таблица Выход Ь -лизина,г/100 мл среды Шта мм Вею ЬасСеиив ВосСоЕе вепи т У(ФЕРМ Р) АТСС 21798 ВечЬосСеиит 3 асСоЕетепСцщ 4,1 АС(ФЕРМ Р) АТСС 21799Н ее ЬасСеи ц в ИасСоЕеееп Со ги 2,5 АД(ФЕРМ Р) АТСС 21800Вем ЬасСвб ц т Вас 1 оКаииеп Сц еАД(ФЕРМ Р) АТСС 21801 3,0 2,8 Ферментацию проводят в течение 72 часна качалке при 31 оС.Количество полученного Ь лизина (в 2 Овиде гидрохлорида) указано в табл. 1.Питательная среда для штаммов АС и АДсодержала 5 мг/л пантотенатакальция и 100 мг/л аденина и гуанина соответственно, ИКлеточную массу штамма Уи мелудаляют из культуральной жидкости центрифугированием, 1 л культуральной жидкостипропускают через колонку с катионообменной смолой (Амберлит У К). Затем Зо-лизин элюируют 3/о-ным водным раствором аммиака. Элюат концентрируют в вакууме. В сконцентрированный раствор добавляют соляную кислоту и помещают в холодильник для осаждения Ь .лизина. 35В результате получают 30,2 г неочищенного кристаллического Ь -лизина солянокислого,П рим ер 2.Штаммытеже, что впримере 1, выращивают в посевной питательной среде следующего состава: глюкоза 1,5% аммоний уксуснокислый - 0,3%,КН РО, -0,1%, Мд 50+ х 7 Н О - 0,04%,+ионы Ре и Ми по .0,2 мг Ъо, биотин -50 мкг/л, тиамин солянокислый - 200 мкг/л,45белковый гидролизат соевых бобов (содержание азота 7%) - 15 мл/л и дрожжевой экстракт - 0,5%. Начальный рН среды 8,0.Посевной материал выращивают при азрировании и перемешивании среды в течение16 час при 31 оС,15 мл посевного материала добавляют к300 мл ферментационной среды следующегосостава: глюкоза - 3%, аммоний уксуснокислый - 0,5%, мочевина - 0,2%, КНРО -0,1%, МЯО 4 х 7 Н О - 0,04%, ионы Ре иМп по 0,2 мг %, биотин - 50 мкг/л, тиамин солянокислый 50 мкг/л, белковый гидролизат соевых бобов - 30 мл/л и тевещества, которые указаны в табл. 2. Начальный рН среды 7,5.Выращивание осуществляют в ферментерах при перемешивании среды со скоростью1500 об/мин и пропускании воздуха в количестве 1 об. воздуха на 1 об, среды в1 мин. Температура 3 1, 5 оС,В процессе ферментации рН среды поддерживают на уровне 7,2-8,0 путем автоматического добавления смеси растворов уксусной кислоты и аммония уксуснокислого всоотношении 0,25 молей аммония уксуснокислого на 1 моль уксусной кислоты, причем концентрация уксусной кислоты равна60%; через 48 час выход 1, пизина солянокислого в культуральной жидкости составляет от 4,8 до 6,4 г/100 мл среды, Результаты приведены в табл. 2,АС5,7 АД АД62 100 100 6,0 Аденин Гуанин 15 мл каждой посевной культуры добав ляют к 300 мл ферментационной среды следующего состава: глюкоза - 1,0%, этанол,5% (1 Ч Н ) 80 - 0,5%, мочевина - 0,2%, КН РО - 0,1%, МАЗО х 7 Н О - 0,04%, ионы Ге+ и.Ми+по 0,2 мг 4 биотин - 50 мкг/л, тиамин солянокислый - 50 мкг/л, белковый гидролизат соевых бобов - 30 мл/л и те вещества, которые указаны в табл. 3. Начальный рН среды 7,5. Таблица 3 УАСПантотенаткальция 5,0 4,4 Аденин Гуанин АД100,0 100,0 5,7 Выращивание проводят в ферментерах45 при перемешивании среды со скоростью 1500 об/мин и пропускании воздуха в количестве 1 объем воздуха на 1 объем среды в 1 мин. Температура 31,5 оС.В процессе ферментации рН среды поддерживают на уровне 7,0-7,5 путем добавления газообразного аммиака.Количество этанола в среде определяют с помощью газовой хроматографии и добавляют по мере надобности, когда содержа- б 5 ние его в среде ниже 0.3%.В табл. 3 приведены данные по содержанию Ь -лизина солянокислого в культу- ральной жидкости каждого штамма после 48 час ферментации. бФ П р и м е р 3. Штаммы те же, что впримере 1, выращивают в течение 16 часна качалке при 3 1,5 оС в посевной средеследующего состава: глюкоза - 1,5%, мочевина - 0,3% КН РО, - 0,1%, МВО х 2 О+4х 7 Н О - 0,04%, ионы Ре - Мл по 0,2 мг%,биотин - 50 мкг/л, тиамин солянокислый -20 мкг/л, белковый гидролизат соевыхбобов - 15 мл/л и дрожжевой экстракт -0,5%. Начальный рН среды 8,0. Я 5 П р и м е р 4, Штаммы - продуценты:ВеаЪас 1 еицм ЬсЫйаелЫв ЬХ -3391 (ФЕРМ Р), АХ -3392 (ФЕРМР), А 1 -3393 (ФЕРМ Р), Я3394 (ФЕРМ Р), АХ -3395 (ФЕРМР), АХ -3396 (ФЕРМ Р). Состав среды и условия культивирования аналогичны примеру 1 за тем исключе нием, что добавляют белковый гидролизат соевых бобов в количествах, указанных в табл. 4, а в среду для штамма АУ -3396 добавляют 50 мл/л гипоксантина. Результаты по выходу , -лизина после72 час ферментации приведены в табл. 4.,0 ючением, что в сре 96 добавляют 50 мг/л ы - продуценты имер 5,то в пример е ферментацию проводят с использование в качестве основного источника углерода уксусной кислоты так, как это описано в ермента вед лица 5 5 -339,4 9 А 0 6,8 3396 50,6 ер 6.Ш в примере ацию пров тем исключением, что в среду для штаммаАТ -3396 добавляют 50 мг/л гипоксантина. ммы - продуценты 4.ят с использованием источника углеродно в примере 3,анные ентац о выходу лизинпредставлены ерез 48абл. 6,а овног к это опис и ц 5 91 3 -3393 -3393 3 -3394 У -339 1,5 3,0 2,0 примере 2 за те ду для штамма А гипоксантина. Данные по кол кислого через 48 ны в табл. 5.526295 Количество полученного Выход, % от испольлизина, г/100 мл среды зованной глюкозы Штамм А 3 - 3424АХ -3425872 4,4 44 3,2 1,8 22 7,2 АХ -3424АУ -3425872 24 32 4,0 Для штаммов АХ -3392 и АТ -3393 вы ход лизина 6,3 г/100 мл среды, что составляет 27,7% относительно использованного этанола.П р и м е р 7. Штаммы - продуценты; ВмуЬцС 1 еиов Ьс 1 оеееи 1 иэ А 1 - 3424 (ФЕРМ Р), А) -3425 (ФЕРМ Р) и872 (контроль). Состав среды и условие культивирования аналогичны При мер 8. Штаммытеже, чтов примере 7, выращивают в течение 18 час на качалке при 31 оС на посевной среде следующего состава: глюкоза - 1,5%, аммоний уксуснокислый - 0,3%, мочевина - 0,1%, КН РО - 0,1%, М ВОх 7 Н ОФФ0,04%, ионы Ге и Ми по 0,2 мг %, биотин - 50 мкг/л, тиамин солянокислый - 200 мкг/л, белковый гидролизат соевых бобов (содержание азота 7%) - 2%. Начальный рН среды 7,5. Состав ферментационной среды; глюкоза - 2%, аммоний уксуснокислый - 0,5%, мочевина - .0,2%, КН РО - 0,1%, М ВО х 7 Н О 0,04%,+ионы Ге и МИ цо 0,2 мг %, биотин - 50 мкг/л, тиамин солянокислый - 50 мкг/л, белковый гидролизат соевых бобов (общий азот 7%) - 2,5%. Начальный рН среды 7,5.После стерилизации к 300 мл ферменПр и мер 9. Штаммытеже, чтов примере 7.Посевной материал выращивают в среде такого же состава, как описано в примере 8, но вместо уксуснокислого аммония добавляют 0,5% этанола и 0,3% мочевины.Выращивание осуществляют в течение 18 час при температуре 31 оС в условиях аэрирования. примеру 1 за тем исключением, что в среду добавляют 200 мкг/л тиамина солянокислого, а в среду для штамма.АХ -3425дополнительно добавляют 3% белкового гидролизата соевых бобов,Данные по выходу Ь -лизина солянокиолого через 72 час ферментации представлены в табл. 7Таблица 7 2 Отационной среды добавляют 15 мл посевного материала.Ферментацию ведут в стеклянных ферментерах общим объемом 1 л при перемешивании со скоростью 1500 об/мин и пропускании воздуха со скоростью 1 объемвоздуха в расчете на 1 объем среды в1 мин, Температура 31-33 оС,В процессе ферментации рН среды поддерживают автоматически на уровне 7,28,0 путем добавления смеси растворов уксусной кислоты и аммония уксуснокислогов следующем соотношении; 0,25 молей уксуснокислого аммония на 1 моль уксуснойкислоты, Концентрация уксусной кислоты60%,Данные по выходу Ь жзина салянокислого через 55 час ферментации представлены в табл. 8.Таблица 8 фермептацию ведут аиалогичю примеру8, но в ферментаииониув среду вместо уксуснокислого аммоиия добвииивт 1% глвжъЭ зы, 1% этанола и 0,5% серийиисааго аммония,В процессе ферментации рН среды поддерживают ни уровне 7,2-8,2 путем добавф.ления газообразного аммиака.бр Количество этанола в среде определяют526295 Таблица 9 6 424 6 0 872 культивированияисключением тоа АУ -3460 дорщюкевого экстракб Таблица 0 7 А 3 АЗ -345 4 А 3 -3460 АЛ -3461 А 5 -3464 9 2 3,2-34 Штаммы - продуцент Прим как в прим Условия ру 2 с исп го источникэкстракта, уровне 7,0В ферме добавляют 2 вых бобов,Результа5 час фер е 11.ферм ентациильзованиемуглероданием, что рим нови аналогичны в качестве ос уксусной кислпитательную ляют 0,5% дрожж ационну 5% белк среду, кроме того,вого гидролизата сое ем исключ средуевого фр 5 ополнительно ентаци едставлены в л с помощью газовой хроматографии и производят добавку этанола, когда его содержание в среде становится ниже 0,3%. П р и м е р 10. Штамм ВлеиЬасймне0 пс 1 оЕелвеи 1 цю АЗ -3429 (ФЕРМ Р 1857). Посевной материал выращивают вбульоне, Готовят ферментационную средуследуюшего состава: глюкоза - 10%,(М Н) 804- 45% КН РО, - 01%, М 5 ЯОх 7 Н О - 0,04%, ионы Ре и Ми по 0,2 мг%биотин - 50 мкг/л, тиамин солянокислый 200 мкг/л, белковый гидролизат соевыхбобов (общий азот 7%) - 1%, СаСО - 51/с,Начальный рН среды 7,0,Среду разливают по 20 мл в качалочные колбы объемом 500 мл и стерилизуют5 мин при 110 оС,ферментацию проводят в течение 72 часна качалке при 31 оС.Выход Ь -лизина солянокислого составДанные по выходу ь -лизина солянокислого после 48 час ферментации приведены в табл. 9. ляет 5,1 г/100 мл среды (51% выхода врасчете на потребленную глюкозу),П р и м е р 11. Штаммы - продуценты:БоииеЬас 1 еиии Д 0 оИисцв АХ -3397(ФЕРМ Р), АЭ -3458 (ФЕРМ Р -1982), АХ -3460 (ФЕРМ Р), АУ -3461 (ФЕРМ Р), СогыпеЬаС 1 Еии щ040(иИч АХ -3464 (ФЕРМ Р) иСолиеЬасЫлцв асеоасадорЬРце АХ -3465 (ФЕРМ Р).Состав сред и условияаналогичны примеру 10 заго, что в среду для штаммполнительно вводят 0,5% д нные по выходу ю -лизина и ас ферментации представлены Н среды поддерживают напо выходу -лизина после526295 Таблица 11 Получено ц -лизина, г/100 мл среды Расход уксуснойкислоты, % Штаммы 22 5,0 А 3 -3397 А 3 -3458 АЗ -3460 АБ -3461 А 5 -3464 А 1 -3465 5,2 23,5 4,7 6,4 22 5,8 0,2 мг %, биотин - 50 мкг/л, тиамин солянокислый - 50 мкг/л, белковый гидролизат соевых бобов (общий азот 7%) - 25%.Начальный рН 7,5,После стерилизации 300 мл ферментационной среды засевают 15 мл посевного материала, ферментацию ведут в стеклянныхферментерах объемом 1 л при температуре31-33 оС перемешивании и продувании 1объема воздуха в расчете на 1 объем средыв 1 мин,В процессе ферментации рН среды поддерживают на уровне 7,2-7,8 путем добвления газообразного аммиака.Количество этанола определяют с помощью газовой хроматографии и добавляютего при падении уровня этанола в средениже 0,3%.Данные по выходу Ь -лизина после48 час ферментации представлены в табл 12. Таблица 12 4,8 А 3 -3397 АЭ -3464 А 3 -3465 20,5 24,0 4,6 601. Способ получения . -лизина путем выращивания продуцирующих его микроорганизмов, относящихся к одному из родов ВМЪас 1 еицж, СоуиеоасЯеицю устойчивых к аналогам лизина, в питательной сре це, содержащей усваиваемые источники углерода и азота, неорганические соли и органические вещества, стимулирующие рост, при рН от 5 до 9, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью упрощения процесса бв П р и м е р 13. Штаммы - продуценты:опеЪас 1 еицв ф 1 цЬХюоъж АХ -3397(ФЕРМ Р), СоииеЬасСебцги РмРлц тА 4 -3464 (ФЕРМ Р,1 оиеЬасЫицю асе 1 оасдор Ы Ь в А 1 -3465 (ФЕРМ 20Р) .Состав посевной среды: глюкоза - 1,5%,мочевина - 0,3%, КН Р 04- 0,1%, Мо. ЬО,хх 7 Н О - 0,04%, ионы ГЕ и Ми лоб,2 мг%,биотйн - 50 мкг/л, тиамин солянокислый - Ж200 мкг/л, белковый гидролизат соевыхбобов (общий азот 7%) - 1,5%. НачальныйрН 7,0,Посевной материал выращивают в течение 18 час при 31 оС при перемешивании ЗОи аэрации,Состав ферментационной среды: глюкоза1%, этанол - 1%, (М Н 4) ,р 04. - 0,5%, мочевина - 0,2%, КН Р 04 - 0, 1%. МЯ 04,х 7 Н О - 0,04%, ионы Ге и Ми по 35 Формула изобретения и повышения выхода продукта, из родов 3.ейЬбйемце и СоулеЬасеи ць используют один из мутантных штаммов, обладаацих наряду с устойчивостью к аналогам лизина потребностью по крайней мере в одном соединении, выбранном из группы, содержащей серии, пролин, алании, никотинамид, пантотеновую кислоту, тиамин, гуанин, гипоксан тин и витамин В, а именно, из рода Вечйайеиаи используют вид В.вас 1 о 1 еаепЬм, штамм УАТСС 21798, АСАТСС 21799, АДАТСС 21800Заказ 5044/476 Тираж 575 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Филиал ППП " Патент", г, Ужгород, ул. Проектная, 4 АДАТСС 21801, А 1 -3424 ФЕРМ Р, А 1 -3425 ФЕРМ Р, А 1 - 3429 ФЕРМ Р, АХ -3391 ФЕРМ Р, А 1 -3394 ФЕРМ Р, А 1 - 3395 ФЕРМ Р, А 3 -3396 ФЕРМ ь Р, А 3 -3392 ФЕРМ Рили А 1 -3393 ФЕРМ Р, из рода СогчиеБэс 1 ЕИц в используют вид С.фц 1 а вцси,м штамм АУ -3397 ФЕРМ Р, АУ - 3458 ФЕРМ Р, А 1 -3460 ФЕРМ О Рили А 3 -3461 ФЕРМ Р, вид С,РРие штамм АУ -3464 ФЕРМ Р, видС.асе 1 оес 4 дорЬ 40 цю, штамм АТ -3465 ФЕРМ Р.2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю - 1 б щ и й с я тем, что в качестве ассимилируемого источника углерода применяют углеводы.3. Способ по и. 1, о т л и ч а ю - щ и й с я тем, что источником ассимили руемого углерода является уксусная кислота.4, Способ по и. 1, о т л и ч а ю - щ и й с я тем, что источником ассимилируемого углерода является этанол. 255. Способ по п. 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что аналогом Ь -лизина является В -(2-аминоэтил)- Ь -цистеин,6.Способпоп. 1, отл ичающ и й с я тем, что в качестве необходимых для роста веществ применяют природные вещества,Приоритет по п. 1 по признакам:27,04.72 -ВгЫ Ьас 1 о 1 еииеи 1 ц в У АТСС 21798;Вгеч Ьас 1 оегвеи 1 ц щ АС АТСС 21799; Вгео 1.ас 1 оГегтеиЫ ги АД АТСС 21800;Вгеи ас 1 о 1 енмеи 1 и в АД 162 АТСС 21801;18,08.72 - В еч 4 Ь а с 1 оение и 1 ц еАХ -3391 ФЕРМ Р;Вгеи ас 1 о 1 егюеи 1 ц е АХ -3392 ФЕРМ Р571 В геч1.ас 1 о 1 егееиЫю АУ -3393 ФЕРМ Р 1572;Вгеи ас 1 оГегюеи 1 цю АТ -3394ФЕРМ Р:Вгеа цас 1 о 1 егщеи 1 цщАЗ -3395 ФЕРМ РЭгей 1 ас 1 оГсиюи 1 ши А 3 - 3396 ФЕРМ Р;19.09.72 Соавив Ы 1 авсию АУ -3397 ФЕРМ Р;30.11.72 - Вгеа цас 1 о 1 егееЫцтАУФЕРМ Р; Вгеч ас 1 оГегвеи 1 цги АУ -3424 ФЕРМ Р,Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:1, Патент ФРГ2034406, кл. 6 в 16/03,