Способ дифференциации зеараленона (f-2) и патулина

союз соВетскихСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 173013 091 3)5 С 12 й 1/00 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТ Я ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ 92, Бюл, М 16юзный научно-исследовательный институт и Казанский веститут им, Н.Э,Бауманаразаев, П.К,Сметов, Р.Г.Госммасов5(088.8)ды исследования в ветерина, М,. Колос, 1971. с.214,4) СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ 3ЕНОНА (Е) И ПАТУЛИНА ии инов рной ЕА Изобретение относит нитарной микробиоло делению и дифферен в в кормах и продукт я к токсикологииния. Несмотря на то, что используеии, в частности к выделенный и очищенный токсин,циации микоток- жительность экспериментов составах животноводст ч до 21 дня. Кроме того, этими мможно определить только токсичня являются; ме- деленноготоксинапоотношениюкости грибов на тест-объекту,тся уже продолляет от етодами ость Вы- данному иса опр Аналогами изобретенитод определения токсичнкультуре простейших и метод определения токсичности грибов на культуре тканей, Аналоги характеризуются тем. что берут определенный биологический объект (культуру простейших, культуру тканей или куриныЕ эмбрионы) и действуют на него исследуемым токсином, Затем по реакции объекта судят о степени токсичности микотоксинов. Для простейших определяют жизнеспособность парамеций. а для культуры ткани отмечают сморщивание клеток и появление зернистости протоплазмы и ядра. Может быть разрыв оболочки клетки или лизис клеОсновным недоста длительность про м аналогов являдения исследова 21) 474652 22) 07.08.8 46) 30.04;71) Всесо ветеринар нарный ин 72) А.Н,У и М.Я.Тре 53) 578.08 56) Мето микологии(57) Изобретение относится к токсикологии и санитарной микробиологии, в частности к определению вида и концентрации микотоксинов. Цель изобретения - повышение чувствительности способа. Сущностью способа дифференциации является специфическая реакция биологического препарата - отрезок тощей кишки кролика - в ответ на действие различных концентраций зеараленона или патулина; которая выражается в изменении моторики гладкой мускулатуры (амплитуды, частоты сокращений и тонуса) и обратимости вызываемых ядами изменений, 3 ил 6 табл. Наиболее близким к предлагаемому является метод определения токсичности грибов на лягушках, который и следует рассматривать как прототип, Используют изолированное сердце лягушки, которое обрабатывают исследуемым токсином. При наличии токсических веществ после введения рабочего раствора через 7 - 10 мин отмечают изменения в работе сердца. Положительные качества прототипа заключаются в том, что при его использовании сокращается время определения токсичности грибов, Кроме того. метод можно использовать для видовой дифференциации токсинов гриба Еозагоп от Зт.асегпапз по5 10 15 20 остановке сердца лягушки в диастоле или систоле.Однако прототип характеризуется очень низкой его чувствительностью (минимальные концентрации токсинов, действующие на сердце 30 - 35 мг ), возможностью дифференциации микотоксинов только по остановке сердца в систоле или диастоле, что позволяет разбить все токсины только на две группы.Целью изобретения является повышение чувствительности способа.Цель достигают использованием отрезка тощей кишки кролика. В термостатируемую ванночку с препаратом изолированного отрезка тощей кишки кролика вводят рабочие растворы изучаемых микотоксинов, создают их определенные концентрации и изучают характер моторики кишечника, Изменения моторики анализируют, составляют графики. а затем сравнивают с кривыми, полученными с использованиемизвестных концентраций тестмикотоксинов,На фиг.1 показана стандартная установка для регистрации моторики препарата отрезка тощей кишки кролика; на фиг.2 - графики изменения моторики тощей кишки кролика под действием различных концентраций зеараленона и патулина; на фиг.3 - график изменения амплитуды, частоты мышечных сокращений и тонуса отрезка кишки кролика под действием патулина,Для работы используют стандартную установкудля регистрации моторики препарата отрезка тощей кишки кролика (фиг,1),Установка содержит кимограф 1, рычажок Энгельмана 2, штатив 3, термостатируемую ванночку 4, препарат 5 отрезка тощей кишки кролика, систему 5 аэрации, ультратермостат 7.В качестве инкубационной жидкости используют раствор Тироде с рН,2, с температурой 37 С, Оксигенацию осуществляют пропусканием через инкубационный раствор пузырьков воздуха, Объем раствора Тироде в термостатируемой ванночке 100 мл. Для приготовления рабочих растворов навеску выделенного токсина 10 мг (порошок) растворяют в 1 мл этанола, после чего инсулиновым шприцем или пипеткой переносят 0,1 мл этого раствора в 0.9 мл этанола и т,д,П р и м е р 1. После установки препарата 5 (фиг.1) в ванночке 4 с инкубационным раствором и начала его "работы" первоначально записывают фоновые сокращения отрезка кишечника в течение 5-10 мин. Затем в инкубационный раствор вводят 0,1 мл первого рабочего раствора и записывают на 25 30 35 40 45 50 55 барабане кимографа 1 (фиг.1) изменения моторики кишечника в течение 5 - 10 мин. Инкубационный раствор, не убирая биологического препарата, сливают и ванночку, заполняют свежим раствором Тироде и записывают характер восстановления функционального состояния отрезка кишечника,Кимограмму анализируют; отмечают ежеминутные изменения величин амплитуды. частоты сокращений и тонуса отрезка кишки. Изменения частоты и амплитуды сокращений переводит в проценты относительно фоновых величин и строят графики. Полученный график сравнивают с графиками, полученными при работе стандартами микотоксинов(фиг.2 А,Б,В-З), Для получения более точных результатов такую же работу проделывают и с остальными рабочими разведениями, используя для этого новые интактные отрезки кишки кролика, По совокупности признаков определяют вид и концентрацию токсина в инкубационном растворе, Зная количество токсина в введенном объеме рабочего раствора, можно пересчитать абсолютно действующее вещество (АДВ) в исследуемом порошке микотоксина.На фиг,2,А,Б,В представлены графики изменений моторики тощей кишки кролика под действием различных концентраций зеараленона и патулина, где перечеркнутая линия. обозначает концентрацию 21 10 г мл; линия с кружками -1 10г мл; линия с точками 1 10 г мл; стрелка - замена раствора Тироде. Зеараленон в концентрации 1 10 г/млснижаетамплитуду мышечных сокращений через 4 мин опыта на 50 (фиг,2); в концентрации 1 10 5г/мл через 2 мин - на 92 ; в концентрации 1 10 г/мл через 1 мин - на 95 , Отмывание отрезка кишки кролика в течение 20 мин нормальным раствором Тироде вызывает значительное восстановление амплитуды мышечных .сокращений, .Так, амплитуда мышечных сокращенийпрепарата отрезка тощей кишки кролика, обработанного Рв концентрации 1 10 г/мл восстанавливается и через 20 мин отмывания превышает фоновые величины на 36. При отмывании препаратов, обработанных Рв концентрациях 1 10 амплитуда сокращений оставалась ниже фона на 69. Амплитуда препарата, обработанного Рв концентрации 1 10 г/мл, при отмывании первоначально увеличивается, а затем вновь снижается.На фиг.2,Б представлены результаты, свидетельствующие об изменениях частоты мышечных сокращений препарата изолиро1730136 Таблица 1 Влияние зеараленона (Р) в концентрации 1 10 г/мл на амплитуду, частоту и тонус отрезки тощей кишки кролика (ТКК) с последующим отмыванием (п = 9)ванного отрезка кишки кролика. По графикувидно, что изменения частоты сокращенийхарактерны для каждой концентрации. Поддействием Гв концентрации 1 10 г/млчастота мышечных сокращений не изменяется. Отмывание раствором Тироде значительно на 380 выше фоновых значенийувеличивает частоту сокращений.Рв концентрации 1 10 г/мл и1 10 г/мл значительно снижает частоту 10сокращений. а последующее отмываниезначительно ее восстанавливает, однако через 10 - 20 мин отмывания частота сокращений остается на 4-18% ниже фоновыхпоказателей. 15Самое значительное снижение тонусаизолированного отрезка кишки кролика вызывает Рв концентрации 1 10 г/мл споследующим значительным восстановлением путем отмывания раствором Тироде. 20Восстановление тонуса отрезка кишки кролика под действием Гв концентрациях1 10, 1 10 г/мл практически не происходило.Патулин в концентрациях 5 10 и 251 10 г/мл в течение 9 мин опыта (фиг.З)вызывает увеличение амплитуды мышечныхсокращений препарата тощей кишки кролика от 10 до 21%,Концентрация патулина 4 10 г/мл 30вызывает уменьшения амплитуды мышечных сокращений (через 9 мин опыта на26%).Отмывание препаратов кишечника, обработанных патулином в различных концентрациях, вызывало однотипные измененияамплитуды мышечных сокращений, выражающиеся в значительном (через 20 мин)снижении амплитуды на 20 - 65%, что является характерным признаком для микотоксина патулина.Таким образом. амплитуда сокращенийотрезка кишки кролика, обаботанного пату-.лином, не восстанавливается, а, наоборот,снижается. Изменение частоты сокращений 45и тонуса отрезки тощей кишки кролика под влиянием различных концентраций патулина не характерны (фиг.З).Предлагаемый способ позволяет дифференцировать заераленон от патулина, определить его АДВ. Наряду с этим. этот способ по чувствительности превосходит прототип в 30 - 150 раз, так как минимально действующая концентрация зеараленона 0,2 мг/О, патулина - 0,7. мг , а прототипа - 30 - 35 мг ,П р и м е р 2, Исследуемый микотоксин при применении 0,1 мл первого рабочего раствора изменял амплитуду, частоту мышечных сокращений и тонус изолированного отрезка кишки кролика соответственно кривым графиков 2,3, что близко по значениям концентрации 1 10 5 г/мл, т,е. 1 мг в 100 мл инкубационного раствора, следовательно, АД В равно 1000 . Зная АД В, можно определить концентрацию микотоксина в исследуемых объектах.Результаты опытов представлены в табл,15,П р и м е р 3, Эксперименты были проведены на 47 биологических обьектах (отрезки тощей кишки кролика). От одного кролика можно получить 20 и более отрезков.Параметры диференциации микотоксинов Ри патулина представлены в табл.5,Результаты исследования по известному и предлагаемому способам представлены в табл, 6.Из табл,6 видно, что предлагаемый способ значительно чувствительнее по сравнению с известным.Формула изобретения Способ дифференциации зеараленона (Г) и патулина, включающий воздействие на биологический Объект исследуемого токсина с последующей регистрацией результатов, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения чувствительности способа, в качестве биологического объекта используют отрезок тощей кишки кролика, а результаты регистрируют по изменению моторики.1730136Продолжение табл 1 П р и м е ч а н и е,- снижение тонуса,Таблица 2 Влияние Р(1 10 г/мл) на амплитуду сокращений, частоту и тонус отрезки (ТКК) с по- -5следующим отмыванием (и - 6) П р и м е ч а н и е, - снижение тонуса,Таблица 3 Влияние Р - 2 (1 10 гlмл) на амплитуду, частоту и тонус отрезки тощей кишки кролика с -4последующим отмыванием (и = 6) П р и м е ч а н и е.снижение тонуса:1 - повышение тонуса,л О 1 ао о ( л сч мо ОО О-о л а о О ООоо Ч; л л а в Ю лсч ао олм(ч о 1 (Ч аСО Ол мсч ю аоО оо а л в а о асОмоо мо СО л л а -о о ч вО а О л л мсч о сч о о МО (,С 1а-Ю сч (ч о Ъ о л л а о- -ооо а л л,4 - о(ч м о аСО- ЛО 1 аоо счо Ч л л 1а -о мсчо моо лмс аа СО в О , , а -о мсчо 1 11 1 1 1 1 1 11 1111 1 1 1 11 1 1(111 1 1 1 1 1 1 11 11 1 1 1 1 1 11 1 1 1 1 1 11 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 11 1 1 1 1 1 1 1 1 1 11 1 1 1 1 11 1 1 1 1 1 1 11 1 11 1 1 1 1 3 1 1 1 1 1 1 11 11730136 12 Таблица 5 Таблица 6 Се е ля шки Улавливаемая Улавливаемая Известный способ П е агаемый способ Кон ент а ия я а 30 - 35 мг/мл Возможность определять природу токсинатолько по остановке сердца в системе илидиастоле. От езок тощей кишки к олика Кон ент а ия я а 1 - 10 мг/мл Возможность определять наличие токсина по блокированию моторики и изменениям амплитуды, частоты и тонуса сокращений и по восстановлению моторики после устранения ействия я а.роизводственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101 Заказ 1488 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ ССС 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5