Реактив для ферментативного определения холестерина

ОП ИСА НИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ) ПриоритетГосударстаенимй кометеСовета Меестроа СССРпо делам кзобретеейи открытей юллетень2 сания 15,06,78 43) Опублико (45) Дата опу ио 30.0 иковаии2) Авторы изобретения аус Беаукамп,убер Иностранная фирма Берннгер Маннхайм ГМБХЗаянител РМЕНТАЧИВСТЕРИНА 4 РЕАКТИ ГО ОПРЕОЕЛЕ медицидствам, ого оп- олестеещество ечивает ализа. ается тем, чт омпоненты в актив ющи о(31) Р 2439348,4 Р Изобретение относится к областины, а именно к диагностическим среИзвестен реактив для ферментативнределения холестерина, содержащий хриноксидазу, поверхностно-активное ви солевой буфер.Однако известный реактив не обеспбыстроты анализа.Целью изобретения является ускорени Эта цель достиг оре с держит указанные к следу х" к личествах, вес, %:Холестериноксидаза 0,025 - 0,500Поверхностно-активноевещество, преимущественно гидроксиноли.этоксидекан 0,0 0 - 1,000Солевой буферныйраствор, преимущественно 0,5 н,фосфорнокислый калий ОстальноеВ качестве поверхностно-активного вешес ва с липофильными и гидрофильными сво ствами применяют,неионогенные детергенты содержащие минимум одну группу ОН в мол куле. Предпочтительными являются производ ные полиоксиэтилена алкиловых, ариловых аралкиловых спиртов, Этими соединениями являются: полиоксиэтиленалкиловый эфир, слож. ный полиоксиэтиленалкиловый эфир угольной кислоты, сложный полиоксиэтиленсорбитанал. киловый эфир угольной кислоты, полиоксиэти. леналкиламины; полиоксиэтиленполноксипропиленовые блокполимернзаты, простой полиоксиэтиленалкиловый тиоэфир, простой полиоксиэтиленалкилариловый. эфир. Можно также использовать гидрооксиполиэтоксидодекан, аддукты окиси этиленалкилфенолов; производные полиэтоксиэтилена сорбитангидридов, а также производные полиоксиэтилена меркаптанового ряда, Из неионогенных поверхностно. активных соединений пслиоксиэтилена пригодны такие, которые имеют уравновешенное соотношение гидрофобного остатка и цепи поляоксиэтилена и которые водорастворимы. Эти соединения вводят в количестве от 0,005 до О,вес. %.Поверхностно-активными вецества ми, со. держащими минимум одну группу ОИ, являются и бутилдиликоль и гексиленгликоль. Эти спирты можно. добавлять для стабилизации в относительно больших количества - от 1 О до 20 об, %, Их пригодность каждый раз определяют экспериментально.УВкачестве анионных смачиваюших средст используют срли желчных кислот, таких какхолевая, таурохолевая и дезоксихолевая, а также соли кислот жирного ряда и саркозиды жирных кислот, Используют .и производные серной кислоты, которые обладают дополнительным свойством стабилизировать известные остаточные продукты окисления некоторых индикаторов (о-толйдин, гетероциклический азин),например сложйый эфир сульфоянтарной кисло;ты алкиларпловые сульфонаты, алкиловые сульфонаты, алкнлполиоксиэтиленсульфаты.Из катионных смачнвателей пригодными являются соли алкилпирндина или триметиламмония, а также соединение хлорид бензотония,Из амфотерных смачивателей применяют, напргмер, имндазолбетаин, а также натрий-ди-(2-этилгекспл)-сульфосукцинат, додецилсуль.фат натрия, олеат натрия, хлористый бензал-,коннй и хлористцй цетилпиридиний,Ионны илн амфотерные.смачиватели применяют в комбинации с пеионными,Неионцые смачиватели. содержащие минимум одну группу ОН, обладают примерно в 5 -1 О раз большей активностью и позволяют получить соответствующее увеличение скороститечения реакции или сокращение ее длительности по сравнению с другими поверхностноактивпыми веществами. Они эффективны и вмалых количествах,Количество доба 6 ляемых Ьоверхностно-активных веществ заВисит от их молекулярноговеса и степени гидрофобности и гидрофильности. Слишком малое количество не дает нужного эффекта активации, а слишком большое -ведет к денатурированию фермента.Оптимальные концентрации для каждогопригодного .поверхностно-активного веществаопределяют экспериментально. Например, длягидроксиполиэтоксидодекана они составляют0,15 - О,б вес. %, аддуктов окиси октилфенолэтилена от 0,03 до 0,1 ьес. %, для производных нолиоксиэтилена сорбитангидридов от 0,15до 0,6 вес. %, для дезоксихолата натрия от0,03 до 0,05 вес. %, для аддуктов окиси алкилфенолэтилена меркаптанового ряда (например,стерокс ЯЕ) от 0,005 до,0,02 вес. %.Реактив для определения холестерина представляет собой раствор, содержащий холестериноксидазу, систему для определения пере-киси водорода, буферный раствор и поверхностно-активное вещество, которым пропитывают,носитель, синтетическую пленку или нх ободочку. Поверхностно-активное вещество содержится в концентрации от 2 до 30%, преимущественно 10 - 20%, по отношению к твердымреактивам. Предпочтительной системой для выявления перекиси водорода является система,.состоящая из перокеидазы, окислительного ин.дикатора, агента набухания или стабилизатора Чтобы приготовить реактив для выявления холестерина в сыворотке крови, используют обычную бумагу для тестов, которую гидрофобируюг или покрывают полупроводящей мембраной из сложных эфиров целлюлозы или используют пленки для тестов. Для изготовленни последних холестериноксидазу, пероксилаз. бчаевиый раствор, индикатор, агенты набухания вместе с поверхностно-активными веществами смешивают в водную дисперсию пленкообразующего полимера,: Эту дисперсию намазывают тонким слоем .на бумагу и высушивают, Если содержащую холестерин кровь накапать на такой. слой реактива и стереть ее примерно через одну минуту, то реактив окрашивается, и глубина окраски зависит от количества холестелина; Реактив пригоден также для выявления иопределения содержания свободного холестерина. Если же имеются сложные холестериновые эфиры,: то из них сначала нужно высвободить холестерин; Это осуществляют путем омыления Водным раствором щелочи.15 Пригодной системой для.выявления образовавшейся при окислении холестерина перекиси водорода является система, содержащая пероксидазу, буферный раствор, окислительные индикаторы. Из пероксидаз предпочтительны пероксидаза хрена, а также лектопероксидаза. В качестве буферных растворов применяют распространенные фосфатные, цитратные или боратные с рН от 4 до 9, преимущественно от 5 до 8. Окислительннми индикаторами служат производные бензидина, например,о-толидин, о.ваиилин, К реагентам можно добавлять распространенные агенты иабухания - алгинат.натрия, карбоксиметилцеллюлозу, а также стабилизаторы для ферментов, например дитиэритрий.Пример 1. О,ОЬ л сыворотки крови вводят Зц в 10 мл 0,5 н.буферного раствора фосфатакалия (рН 7,5), содержащего 0,4 вес; % гидроксиполиэтоксидодекана.Экстинкцию (Е,) считывают при 240 нм всоответствующем спектральном фотометре, а реакция начинается с добавления 0,02 мл (0,Щ стабильной при хранении, освобожденной от следов смачивателя холестериноксидазы в 1 М растворе сульфата аммония. Через 3 мин экстинкцию (Е) считывают снова.Концентрацию образовавшегося свободного46 колестерина и общего холестерина определяютиз разницы между первым и вторым считыванием с учетом молекулярного коэффициента экстинкции для холестерина при 240 нм (1 Г,5 см/моль). Измерение типичной пробы дает 62 мг % свободного холестерина и 4 ф 167 мг % общего холестерина (после омыления), При сравнительном анализе без добав- ления поверхностно-активного вещества продол жительность реакции составляет 15 мин. Уда.ление следов смачивателя для улучшения стабильности хранения фермента осуществляют .при помощи гидрофобных адсорбирующих смол.Пример 2, 0,05 мл сыворотки крови вводятв 10 мл 0,5 н,буферного раствора фосфата калия (рН 7,5), содержащего 0,2 вес. % гидроксияолиэтоксидодекана и 0,03 вес. % дезо- Я . ксихолата натрия. Экстинкция (Е ) . считывается при 240 нм на спектральном фотометре, и реакция начинается с добавления . 0,02 мл .(0,111) стабильной при хранении, освобожденной от следов смачивателя холестериноксидазы в 1 М растворе сульфата аммония. Через 3 мин экстинкцию (Е) снова считывают.5Концентрацию образовавшегося свободного холестерина и общего холестерина определяют аналогично примеру 1. Измерение типичной пробы дает 65 мг % свободного холестерина и 170 мг % общего холестернна (после омыления).Пример 3. 0,05 мл сыворотки крови вводят в 10 мл 0,5 н,буферного раствора фосфата калия (рН 7,5), содержащего 0,2 вес. % гидроксиполиэтоксидодекана и О, вес. % вторичного сульфата алкила. Зкстинкция (,Я,) считывается при 240 нм в спектральном фото- метре, и реакция начинается с добавления 0,02 мл (О,1.) стабильной при хранении, освобожденной от следов смачнвателя холестериноксидазы в 1 М растворе сульфата аммония. Через 3 мин экстинкцию (Е,) снова считывают, Концентрацию образовавшегося свободного холестерина и общего холестерина определяют аналогично примеру 1, Измерение типичной пробы дает 62 мг % свободного хо- лестерина и 167 мг % общего холестерийа (после омыления).Пример 4. Фильтровальную бумагу пропи. тывают раствором следующего состава, мг100 мл дистиллированной воды:Цнтратный буфернййраствор (1 М, рН 5,25) 20Холестериноксидаза 100Пероксидаза 50Зту бумагу высушивают прн 40 С н импрегннруют растворами по 0,2 г о-толнднна в 100 мл хлористого метилена, каждый из которых, кроме того, содержит пог следую 1 цнх поверхностно-активных веществ: полноксиэтилеитрибутилфеноловый эфир, яолиоксиэтпленсорбитанмонолаурат, полиоксиэтнленноцнлфеноловый эфир, полиокснэтнленлаурвеовый эфир, полноксиэтнленцетиловый эфир, нолножсаэтиленстеарат, полиокснэтнлендодецнлтио. Эфнр. После сушки получают бумагу для тестов, котозая окрашивается холестеринсодержааими сыворотками в зеленый цвет. Когда сы ф воро 1 ки одновременно содержат сложный хо, лестернновый эфир, то получают более. резкую зеленую окраску, если сыворотку до этого предварительно разбавляют одной кавлей раствора холестеринэстеразы. Бумага для тестов, не содержащая поверхностно-активных веществ, ие реагирует с указанными сыворот. ками.Пример 5. Фнльтровальную бумагу пропитывают раствором следующего состава, г/100 мл дистиллированной воды: 5 ОЦитратный буферныйраствор (1 н., рН 7). 20 (мл)Холестериноксидаза 0,10Холестеринэстераза 0,25Пероксидаза ., 0,05Эту бумагу высушивают при 40 ОС и импрег. ннруют растворами по 0,2 г.о-толидина в 100 мл хлористого метилена, которые, кроме того, содержат каждый по 0,5 г следующих поверхностно-активных веществ: полиоксиэтиленкокоат, полирксиэтиленолеат, полиоксиэтиленполи. Опрониленгликоль, полноксиэтиленстеарила мни,полиоксиэтиленглицеринмонолаурат.После сушки получают реактив для тестов,который, реагируя с сыворотками крови, окрашивается в зеленый цвет, если они содержатхолестерин или сложный холестериновый эфир., Бумага для тестов без поверхностно-активныхвеществ не дает реакции на указанные сыворотки.Пример 6, Предварительно импрегнирован.ную бумагу по примеру 4 дополнительно импрегнируют растворами по 0,3 г о-толидина в100 мл ацетона, содержащими по 1,5 г следующих поверхностно. активных веществ; диоктилеульфосукцинат натрия, натриевая сольдодецилбензолсульфоновой кислоты, натрневаясоль лаурилполигликольэфирсульфата, лаурилсаркозинат натрия, лаурат натрия, холеваякислота, дезоксихолевая кислота, таурохолатнатрия.Этот реактив обладает такимн же свойствамн, как и реактив по примеру 4, но он дольше сохраняет стабильность красок реакции.Пример 7, Предварительно импрегнированную бумагу по примеру 5 дополнительно нм.прегнируют растворами, содержащими по 0,4 го-толнднна и по 0,5 г следующих поверхностно-активных веществ: хлористый лаурилпн.риднн, хлористый бензетоний, хлористый цетнлтриметнламмоний, 1-гидроксиэтил-карбоксиметил-алкнл-имидазолинийбетаин. Свойст.ва этого реактива аналогичнь свойствам реактива по примеру 5,Пример 8, Фильтровальную бумагу пропп.тывают раствором следующего состава, г 100 млдистиллированной воды;Фосфатиый буферныйраствор (1 и., рН 6) 25 (мл)Холестериноксндаза 0,10Пероксидаза 0,05Холевая кислота 1,00Ацетон 10 (мл)Згу бумагу высушивают прн 40 С,н 4 о.полннтельно пропитывают растворами скисли.тельных. индикаторов в 100 мл ацетона, Коли.честно индикаторов, нх химическая структуран нх реакция окраски с содержащими холе.стерни сыворотками приведены в таблицеПример 9, Приготавливают смесь из следующих компонеитов г/50 мл воды:Дисперсия поливинилпропионатаАлгинат натрия (1,85% в0,5 молях фосфатногобуферного раствора,рн 5,5) . 35,00Холестериноксидаза 0,50Пероксидаза 0,25Диоктнлсульфосукцинат натрия 1,00о-Толидин (растворенный в 6 млацетона) 0,60Зту смесь растягивают в пленку трлщн.ной -300 мм по мокрому или намазывают на.твердый носитель и высушивают при 35 С, Если на пленку накапать кровь, содержащую холестерин, н стереть ее через несколько ми61373 7нут, то пленка окрасится в зеленый цвет различной глубины в зависимости от концентрации холестерииа. Если затем к этому препа. рату добавить еще 1,0 г холестеринэкстеразы, то получится пленка, при помощи которой мож. 0,3 Азино бис-(Я -етнлбензотиазодонсуде.фокисдота 6)-риаммониеван соль О 2 Фиолетово-синийФиолетовый 0,1 Био (И алиидззшодон 2) азин(И метидбензотиазолон 2)-1-фенил,4-риметидтриазодон-б азин О,Э Формула изобретения 0,025 - 0,500 Реактив для ферментативного определения холестерина, содержащий холестериноксидазу, новерхностно-активное вещество и солевой буферный раствор, отличагощийся тем, что, с целью ускорения анализа, он содержит указанные компоненты в, следующих количествах: вес. %: 0,010 - 1,000 Остальное Составитель С, МалютинаТехред О. Луговая Корректор И. Гокснч Тираж2 Подписное Редактор И. ХублароваЗаказ 36 МД БНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам нзобретецн н открытий3035, Москва, Ж 35, Раушсная наб д. 45 Филиал ППП Патентэ, г. Ужгород, ул, Проектная, 4о Ванилднлирен-о ваниддоилгирразов Азино бнс-(М -адиилиннодон.судьфоиисдота)-рнамМонневансоль но определить повышенное содержание сложных холестериновых эфиров.Гредлагаемый реактив для форментативного определения холестерина позволяет быстро проводить анализы. Холестериноксидаза Поверхностно-активное вещество, преимущественно гидроксинолиэтоксидеканСолевой буферный ,щ раствор, преимущественно 0,5 н.фосфорнокислый калий