Способ получения фруктозы из глюкозы

.и : 2 0 ц 582284 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз СовотокихСоциалиетичвиих Республик(45) Дата опубликования описания 06,01,78(51) М. Кл. С 13 К 11/00 сударственный коми Совета Министров ССло делам нзобретенин открытий)УДК 6 8.8) 72) Автор изобретени ИностранецАллан Мессинг(США)ностранная фирмарнинг Гласс Воркс(США) альф 71) Заявитель Ъ ИЗ ГЛ 3 Ъ лонку, через которуюв условиях изомеризазу раствор. Оптимальживания раствора глюпаратом от 50 до 70(предпочтительно приный препарат имеетлах рН, при которыхглюкозоизомераза обтивностью. оНижний предел (100 А) диаметра пор частиц окиси алюминия, используемой для адсорбции глюкоизомеразы, подобран, исходя из наибольшего размера молекул этого ферменота, составляющего также100 А. Благодаря этому молекулы могут входить в поры, что обеспечивает использование большой поверхностной площади для загрузки фермента.оЕсли средний размер пор больше 1000 А, поверхностная площадь для адсорбирования уменьшается и, следовательно, уменьшается поверхностная площадь для загрузки фермента. При этом возможно отделение фермента и выход из пор носителя. Оптимальный размеропор носителя от 140 до 220 А. итель5 до 2(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ Изобретение относится к способам ферментативного гидролиза глюкозы.Известен способ получения фруктозы из глюкозы 11, согласно которому раствор глюкозы, содержащий от 5 до 90 вес. % глюкозы, 5 выдерживают с ферментом - глюкозоизомеразой, полученной из микроорганизмов Ягеротпусез и стабилизированной на носителе, при рН от 6 до 9 и температуре от 20 до 80 С. Согласно известному способу носитель пред ставляет собой клетки, причем закрепляется глюкозоизомераза на них путем нагрева смеси клеток и фермента при низкой температуре,Однако такой способ недостаточно эффективен - степень перехода глюкозы во фруктозу 15 составляет 45%.С целью повышения эффективности процес- са и ускорения его в предлагаемом способе предусмотрено в качестве ферментного препарата использовать глюкозоизомеразу, адсор бированную частицами окиси алюминия, имео ющими поры диаметром от 100 до 1000 А,В предпочтительном варианте этот нос имеет размеры частиц в пределах от 2 80 меш (по стандарту сит США). Полученный по предлагаемому способу фер ментный препарат помещают в проточную конепрерывно пропускают ции содержащий глюконая температура выдеркозы с ферментным пре- С при рН от 7,2 до 8,2 7,4 - 7,8). Этот ферментщелочность в тех предесвязанная с носителем ладает оптимальной акВыбор буферной системы зависит от степени кислотности в растворе субстрата, создаваемой самим раствором при наличии активных ионов, которые могут быть введены в субстрат и во внутрь пор, например ионов кобальта или магния. В этом случае кислотного действия этих ионов можно избежать путем добавления сульфитных солей.Для приготовления ферментного препарата согласно описываемому способу желательно, чтобы носитель, используемый для адсорбирования глюкозоизомеразы, обладал следующими свойствами: Размер пор, А:средний 175 минимальный 140 максимальный 220Поверхностная площадь, мг/г 100 Объем пор, см/г 0,6 Пористость, % 62,5 Размер частиц, меш 25 - 60 П р и м е р 1. Около 5 г состава, содержащего - 444 г глюкозоизомеразы, полученной из микроорганизма Ягер 1 опусез, добавляют к 28,7 мл 0,1 М раствора ацетата магния в стакане емкостью 50 мл. Содержимое стакана перемешивают 25 мин при комнатной температуре, а затем фильтруют через фильтровальную бумагу, Остаток на бумаге несколько раз промывают и промывные воды собирают непосредственно в фильтре для отделения фермента. Общий объем фильтрата составляет 50 мл. Затем 500 мг частиц пористого алюминия вводят в сосуд с круглым дном емкостью 50 мл, добавляют 10 мл указанного раствора глюкозоизомеразы. Сосуд помещают во вращающийся испаритель, в котором создают вакуум, и вращают в бане при 30 - 45 С с интервалом в 25 мин. Затем в сосуд добавляют 10 мл раствора глюкоизомеразы и, спустя 35 мин, при тех же условиях подвергают содержимое сосуда испарению.При тех же условиях добавляют раствор глюкозоизомеразы с последующим испарением в течение 4 ч. Процедуру повторяют два и более раз с отделением 10 мл раствора глюкозоизомеразы. Затем в сосуд вносят еще 7 мл раствора глюкозоизомеразы и продолжают испарение 1 ч и 10 мин при 45 С, После этого сосуд извлекают из испарителя и охлаждают его содержимое в течение двух дней,Общее количество раствора глюкозоизомеразы, добавленное к пористому алюминию, составляет 4 мл. К полученной композиции добавляют 50 мл 0,1 М буферного раствора малеинового натрия (при рН 6,8 - 6,9), содержащего 0,005 М раствор хлористого кобальта и 0,001 М раствор сульфата магния. В течение часа при комнатной температуре берут пробы. Экстракт объемом 50 мл анализируют, После этого композицию промывают 20 мл воды и 10 мл 0,5 М раствора хлористого натрия, затем окончательную промывку проводят в воронке из пористого стекла 50 мл воды. 5 1 О 15 20 25 зо 35 40 45 50 55 60 65 Композицию переносят в коническую колбу объемом 50 мл и хранят в буферной смеси при комнатной температуре с периодическими анализами общей пробы через 106-дневные интервалы.Получают следующие результаты:Пробы ферментного 39,8 международныхэкстракта (50 мл) единиц (МЕ) глюкозоизомеразы на 1 млСредний объем пробы 130 МЕ глюкозоизокомпозиции меразы на 500 мгпробыСредний объем за МЕ глюкозоизогрузки меразы на 1 гП р и м е р 2. Носитель, аналогичный носителю, применяемому в примере 1, предварительно обрабатывают. Для этого 11 г частиц окиси алюминия помещают в стеклянный цилиндр с притертой пробкой, куда добавляют 100 мл 0,05 М раствора ацетата магния и 0,01 М раствор ацетата кобальта при рН 7,6. Закрывают пробку, перемешивают содержимое путем переворачивания цилиндра, после чего его помещают в водяную баню с температурой 60 С. Спустя 15 мин композицию декантируют, добавляют в цилиндр 100 мл свежего ацетата магния - кобальта, перемешивают переворачиванием и оставляют в покое на 2 ч и 30 мин при комнатной температуре.Сырой раствор глюкозоизомеразы, содержащий 590 МЕ глюкоизомеразы на 1 мл в 0,6 М насыщенном растворе сульфата аммония, очищают для реакции с алюминием. С этой целью к 40 мл раствора глюкозоизомеразы добавляют 1,4 г сульфата аммония для осаждения фермента. Шлам перемешивают 20 мин. Затем путем центрифугирования жидкость удаляют, а к осадку добавляют 12 мл раствора ацетата магния - кобальта, и смесь перемешивают. После этого к раствору фермента добавляют 3 мл 0,5 М раствора бикарбоната натрия и перемешивают для растворения фермента. Полученный раствор помещают на 15 мин в водяную баню с температурой 60 С, После бани раствор центрифугируют 15 мин при скорости 16000 об/мин и температуре 2 С, Светлый раствор фермента отделяют, а осадок удаляют. Полученный раствор фермента (28 мл) имеет рН 7,5, Если во время очистки активность не изменяется, то раствор содержит 23600 МЕ глюкозоизомеразы.Затем приготовляют ферментный препарат. Для этого раствор ацетата магния - кобальта после переворачивания цилиндра декантируют от частиц пористого алюминия, К последнему в цилиндре добавляют 28 мл раствора фермента, закрывают цилиндр пробкой, перемешивают содержимое путем переворачивания и помещают в водяную баню с температурой 60 С. В течение 2 ч и 30 мин цилиндр переворачивают каждые 15 мин. Затем его извле. кают из бани и оставляют при комнатной температуре еще на 2 ч, переворачивая каждые 30 мин, после этого оставляют в покое на ночь.682284 Формула изобретения Составитель М. Андреева Техред Н, Рыбкина Корректор Л, Котова Редактор Н, Хубларова Подписное Заказ 124/16 Изд. Ма 110 Тираж 484 НПО Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Типография, пр. Сапунова, 2 Получают 28,5 мл (рН 7,1) раствора фермента, который декантируют, а затем анализируют. Композицию промывают 60 мл дистиллированной воды, затем 40 мл 0,5 М раствора хлористого натрия и 40 мл раствора ацетата магния в кобаль,Из цилиндра отбирают 3 пробы общим весом 1 г для анализа. Оставшиеся 10 г помещают в колонну с температурой нагрева 60 С. В колонну подают раствор, содержащий 50 о/о глюкозы и 0,5 М раствор сульфата магния с буферным раствором сульфата натрия для доведения рН до 7,7 - 8,0.В течение первых 26 ч в композицию, пропускаемую через колонну, вводят 0,001 М раствор хлористого кобальта, затем кобальт вводить прекращают, и при дальнейшей работе колонны роль активатора играют только ионы магния.Исходная объемная скорость потока в колонне 190 мл/ч. Объем получаемой фруктозы составляет 80 - 85 о/о от теоретического и поддерживается путем снижения объемной скорости потока через различные интервалы времени. Колонна работает 31 день, К концу работы в результате уменьшения подачи она подсыхает и высыхает полностью через 15 ч, Период изомерного полуперехода перед использованием показывает, что он имеет загрузку в 381 МЕ глюкозоизомеразы, Это свидетельствует о восстановлении 17,8% активности от всего количества глюкозоизомера зы (в МЕ), адсорбированной в носителе,Анализ прореагировавшего ферментногораствора (28,5 мл) показывает, что он содержит 161 МЕ глюкозоизомеразы, а восстановление активности в этом прореагировавшем 10 растворе составляет 19,4 о/о.Величина рН колонны поддерживается впределах 7,4 - 7,8 путем соответствующего регулирования подачи материала. Общая загрузка колонны 3810 МЕ.15 Способ получения фруктозы из глюкозы путем выдержки раствора глюкозы с фермент 20 ным препаратом, отличающийся тем, что,с целью повышения эффективности процессаи ускорения его, в качестве ферментного препарата используют глюкозоизомеразу, адсорбированную частицами окиси алюминия, име 25 ющими поры диаметром 100 - 1000 А,Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1, Патент США3694314, кл. 195-31, 1972.