Способ получения нерастворимого комплекса пенициллинамидазы путем связывания фермента с ионитом

ОП ИСАНИЙИЗОБРЕТЕНИЯИ АТОРСКОММ СВН ВТМЬОЕУ(й) Дополиительиое. к авт, свил ву(И) Зайвлеио 23,01,75(3)21003 Ю 3е арнсоедииеиием заявки РЬ" Своа Советских Сармлистииесмиа ресаубеа) Приоритетубликоваио 25,09,77,Бюллетень В 35 ата опубликования описаний 25.10,77П, С, Ныс, Е, М, Савицкая, Т, С, Колыгина,Н. Н, Шелленберг, В, К, Антонов и Л, В, Козл АВифммзобрееиа Всесоюзный научно-исследовательск ижтитут антибиотиков(54) СПОСОБ ОЛУЧЕНИЯ НЕРАСТВОРИМОГО КОМП ПЕНИЦИЛЛИНАМИДАЗЫности и стабильнос достигается тем, ч с водорастворимым тическим соединепн на анионите.Способ осуществ зом ляют следующим Вначале проводят ковалентное связывание ПА с низкомолекулярным ароматическим соединением, содержащим, помимо гидрофобных и сильнокислых, также реакционноспособные группы, лри рН 7,0, ионной силе 0,1 М иоф фтемпературе 28 С в течение 2 ч, Затем не вступившее в реакцию низкомолекулярное соединение отделяют от модифицированной пениииллинамидаэы (МПА) на колонке с сефадексом Ст -25, уравновешенным 0,01 М фосфатом буфером, рН,5. Условия связывания обеспечивают ф" 100%-ное сохранение активности фермента.Полученную МПА сорбируют ионитамн, предпочтительно макроаористыми анионитами при рН,5 и 0,01 М ионной силе в течение 24 ч при перемешивании и температуре -5 С, Полученную ИПА отделяют фильтИзобретение относится к получению нерастворимых в воде ферментных препаратовИзвестен сиособ получения нерастворимого фермента; наиример пеииииллинамидаэы (ПА), заключающийся в том, что нерастворимый носитель обрабатывают ароматическвъе соедвнениями, содержащимиазпдиые или триазильже группы, в частности аминодихлор-свмм-триазином, послечего фермент ковалевтно связывают припропускаиии чевез колщку с модифицированным носителем Я.Известен также способ получения иммобилизованной пеинцивлинамидазы (ИЛА) путем сорбции (ПА) иа носителях разной природы с. последующим ковалеитным связываниемм сорбированной ПА и нжителя при помощи функционального реагента - глутаровоаль дегида 121,Недостатком этих способов является невысокая эффективность связывания, а также низкая удельная активность и стабильвость комплекса,Белью изобретения является повышениеэффективносхи связывания, удельной актввкомплекса, Эта цель фермент компенсируют олипиклическим аромаи, а затем сорбируют84711,3 к активности, взятой на связывание, равен;61%. Для получения ИПА была снята зависнмооть максимальной скорости реакции отрН в интерввпе рН 5,5-8,8. Максимум катвпитической активности ИПА находится винтервапе рН 6,8-6,7, что нв единицу рНкислее, чем соответствующий интервал рНдпя нативного фермента (рН 7,5-7,8). Время йопураспада полученной ИПА в максимуме ее каталитической активности (рН,5)равна 740 ч, что в,10 рвзбопьшевремениполураспада соответствующего нативногофермента в максимуме его активности.П р и м е р 3. Получение 6-аминопенциппановой кислоты (6-ЛПК).5 г ИПА с активностью 6200 ед/г влажной ИПА (влажность 54%) инкубируют втечение 240 мин с 4 г К-сопи бензиппннциппина (10,7 м моля в 80 мп дистиппироввнной воды при 20 С и автоматическомподдержании рН 6,5 28%-Рь м растворомаммиака в. реакторе периодического действия, После отдепения фермента попучвют80 мп раствора с концентрацией 6-АПК0,119 ммопь/мп, Раствор охлаждают доф о5-6 С и обрабатывают 1% (по объему) акзивированного угля, Целевой продукт выдепяют из раствора при установлениирН3,8-4,1, Кристаллический осадок фильтруют,промывают и сушат, Попучают 1,67 г6-АПК с содержанием 95%, Иммобипизованный фермент снова инкубируют с 4 г К-сопи бензилпенициппина в 80 мп дистиппиро-.ванной воды и выделяют целевой продукт,как описано выше. Операцию повторяют до100 раз и бопее. Выход целевого продуктапосле проведения 100 операций составпяет80,5% от теоретического, чистота 6-АПК 96,8%,В соответствии с методикой, описаннойв примере 1, быпа произведена модификация ПА рядом соединений, отпичвющихсяприродой реакционноспособных и ароматических групп(ядрабензопа, нафталина, внтрахинола), а также количеством ионогенныхгрупп. Поспедующую сорбцию полученных,препаратов модифицированной ПА анионитомАмберпитом Э%А -938 и дальнейшую обработку цопученной РПА 1 троводят, как описано выше. Способ попучения нерастворимого комплекса пенициллинамидвзы путем связывания фермента с ионитом, о т л и ч в ю щ и йс я тем, что, с цепью повышения эффективности связывания, удельной активности и стабильности комплекса, фермент предвв 3рацией, суепендируют в 1 М аС 2 (перемешиванае 2 ч, температура -5 С) дпя эпюциинепрочно связанного фермента. и промывуотводой.Получают ИПА с активностью до 6000 ед/г бвлажного носитепя при выходе активностидо 60%,П р и м е р 1. Модификация (ПА).200 г пеофипьно высушенного Ърепарата ПА с общей активностью 80010 ед. 10 .3ПА, удепьной активностью 20 10 ед/мгЭбепка и 48 мг ярко-гопубого активногодихпортриазинового краситепя растворяютв 18 мл 0,2 М фосфорного буфера, рН,8.Раствор выдерживают в течвюще 2 ч при 15о28 С, а затем отдепяют избыток несвязавшегося краситепя ив копоике с сефвдексом4 -25, Объем колонки 60 мп, навесивсефадекса 17,0 г. Перед звнопнением колонки сефадексу дают набухнуть в 0,01 М 20фосфатном буфере, рН -7,5, На колонку ссефадексом наносят 14,7 мп раствора, содержащего модифицированную ПА и избытоккрасителя, МПА впюируют 0,01 М буфером,рН,8 и получают 25 мп раствора МПА 5с общим содержанием фермента 78,0 10 ед.ЭПА, т,е. 98% от активности, взятой нвсвязывание. Содержание коввпентно связан ного красителя оцределяют спектрофотомеч;рически, оно составляет 6,0 10% 30П р и м е р 2. Иммобипизвция ПА,К 1,0 внионита Амберлит Э%А -938(сипьноосновный анионит на основе стиропдивинипбензопа), зернение 0,25-0,5 мм,который. предварительно бып приведен в З 5равновесие с 0,01 М фосфатным буфером,рН,5, добавпяют 3 мп раствора модифицированной ПА, приготовленной в соответствии с примером 1 (МПА), и 17 млОэ 01 М фосфвтного буфера рН,8. Общее 40содержание мента, взятого на сорбцию,равно 9,3 10 ед, ПА. Сорбцию ведут в. отечение 1 сут при перемешиввнии при -8 С,Подученную ИПА запивают 20 мп 1 М йаС 0и десорбируют несвязавшуюся ПА при переомешивании в течение 1 ч(-8 С, операаиопроводят дважды), Затем ИПА промывают0,1 М фосфатным буфером (рН,5) и водой, ферментвтивную активность определяютв условиях, описанных дпя нвтивной ПА. Э 1Получают 0,91 г ферментного препарата сактивностью 600 ед/г влажной ИПА (ф Е,ИПА), Эффективность связывания, равнаяотношению выдепяемой активности ИПА ктеоретически ожидаемой, которая опредепяезся по разности между активностью, взятойнв связывание, и активностью в фильтрвте,элюатвх и промывках, составляет 68%. Общий выход активности ИПА, представпяющий отнощение выявляемой активности ИПА формула изобретения547113 Составитепь С, МапотиньРеоактоо Г, Дааятко Текрао н. Анореячук Корректор А. КранченкоЗакан 8801/46 Ткраж 84 ПодписноеЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССРпо дедам изобретений и открытий113035, Москва, Ж-ЗБ, Раушская Наб., д, 4/б Фипиал ППП фПатентфр г, Ужгород, ула Проектная, 4 рительно конденсируют с водорастворимым понициклическим ароматическим соединением, а затем сорбируют на анионите.Источники информации, принятые во внимание при экспертизе; 1. Патент Вепикобритании 1302706,Кл, С ЗН, 1959,2, Патент ФРГ 2143062, Кл. 6 В 22/04,1 972.