Способ получения -норлейцин13-мотилина

Соав Свеетскик Социалистических Республик(51) М. Кл.а С 07 С 103/52 22) Заявлено 27,03,74 (21) 2013928 Государственнын комит Совета Министров СС по делам нзобретени 3) УДК 547.964.4.и открытии та опубликования описания 01.1(72) Авторыизобрете рнст Егер, Регинанс Штокер Эрих Вюнш,Шарф Заявитель мафердерунг дерфй акс 1.-но1 бу получе- родного докозапе алога при- лейцин-мотилпн тида мотилина а общей формул и - б 1 тт(15) (19) г 9 - И 1 е (1 г ) (131 полнои послеключающийся в ые фрагменты, угом с помощью Х - оксисукцингрупп используолизом групписпособ получени ти секретина, за ставляют отдельзывают друг с д илкарбодиимидачестве защитных тщепляемые ацид нил вый нил- лутосло цоть литературе нет сведении о спос я соединения формулы 1 или к угих аналогов мотилина. ил- орСогласно изобр получения соедин щийся В том, что цельные фрагмент тению описывается снос ния формулы 1, заключа получают защищенные о нпл- лейИзвестендовательностом, что сокоторые свядициклогексимида. В кют легко оровки.Однако вбе получениких-либо дрО П И С А Н И Е 1 и) 562193ИЗОБРЕТЕН И Я(31) Р 23 15271.8 (33) ФРГОпубликовано 15,06.77, Бюллетень че 22 Иностранцы рхард Вендльбергер Карл-Хайнц Даймер55 60 65 фрагмент Ч - 0-трет. - бутил - треонилтрет.-бутил-тирозил-глицин (аминокислоты6 - 8),фрагменты И - Ка-трет, - бутилоксикарбонил-фенилаланил - валил - пролил - изолейцил - фенилаланин (аминокислоты 1 - 5);полученные фрагменты 1 - И конденсируют друг с другом известным способом, например модифицированным карбодиимидным,с помощью дициклогексилкарбодиимид - Моксисукцинимида; из полученного защищенного полипептида (аминокислоты 1 - 22) удаляют защитные группы при помощи трифторуксусной кислоты с последующим выделением целевого продукта известным способом.В примерах применяются следующие, обычные в химии пептидов, сокращения и символы:сокращения аминокислот, у которых, какправило, речь идет о трех начальных буквах,числовые данные в скобках, которые неимеют никакого другого дополнения, если соответствующее соединение еще раз не появляется в форме другого производного, которое имеет подряд дополнения а, 6, с, и т. д.,если исходят из а и получают другие производные,1. - конфигурация,2 - бензилоксикарбонильный радикал,ВОС - третичный бутилоксикарбонильныйрадикал,РССР - способ с дициклогексилкарбодиимидом,ЭССЭ/НОЯ.1 - способ с дициклогексилкарбодиимид-И-оксисукцинимидом,ЭССР/НОВ 1 - способ с дициклогексилкарбодиимид-оксибензтриазолом,РАМ - фосфоразо-метод,И 1 - радикал М-оксисукцинимида,КР - радикал р-нитрофенила,1 Вц - радикал третичного бутила,РВ 81 - дибензолсульфимид в качестве солеобразователя,Ме - метильный радикал,ТРЕ - трифторуксусная кислота,1. У. - в вакууме. П р и м е р 1. Получение фрагмента 1 (18 - 22): Н - Ып - 01 Вц (22 в), полученный из Х - Ып - ОН (22 а) этерификацией третичным бутиловым эфиром уксусной кислоты с последующим удалением гидрогенолизом бензилоксикарбонильной защитной группы, соединяют с Х - Ыу - 08 ц (21) в 2 - Иу - 61 п -- 01 Вц (21 - 22 а); полученный после удаления гидрогенолизом Х-защитной группы Н - 61 у - 61 п - 01 Вц (21 - 22 в) соединяют с 2 - Азп - ,уз (ВОС) - ОН (19 - 20) по известному способу с ЭССР/НОБц в 2 - Азп - .уз (ВОС) - 61 у - 61 ц - 01 Вц (19 - 22 а), Головную компоненту (19 - 20) можно было получить аминоацилированием Н - .уз (ВОС) - ОН (20) с Х - Лзп - ОМР (19) при обычных условиях. 5 1 О 15 20 25 зо 35 40 45 50 Удаление защитной группы с Х - Азп - 1.уз (ВОС) - 61 у - 61 п - 01 Вц (19 - 22 а) каталитическим гидрогенолизом дает производное тетрапептидного сложного эфира (19 - 22 в), которое соединяют с Х - Лгд (о,а - Х,) ОМР (18) в 2 - Агу (б, ж - Х) - Азп - 1 уз (ВОС) - 61 у - 61 п - 01 Вц (18 - 22 а),Эксперимент проводят следующим образом.А. Дибензолсульфимидная соль .-глутамин-трет.-бутилового сложного эфира.103 г бензилоксикарбонил-глутамин-трет.- бутилового сложного эфира, полученного по известному способу, в 2 л метанола каталитически гидрируют (над палладиевой чернью) известным образом при добавлении 91 г дибензолсульфимида в 500 мл метанола при рН 3,5.Фильтрат упаривают в вакууме, а затем азеотропной отгонкой с бензолом; из этилацетатного раствора маслянистый остаток при добавлении диэтилового эфира кристаллизуется. Из метанола/диэтилового эфира получают кристаллы с т. пл. 135 - 136 С; 1 ад = =+10,78 (с 1,0; метанол), Выход 146 г (97% от теории) .Б. Бензилоксикарбонилглицил.-глутаминтрет.-бутиловый сложный эфир.115 г дибензолсульфимидной соли 1.-глутамин-трет.-бутилового сложного эфира, суспендированного в 800 мл дихлорметана, смешивают при перемешивании с 32,2 мл триэтиламина и после этого с 70,5 г бензилоксикарбонил-глицин-К-оксисукцинимидного сложного эфира. После перемешивания в течение 24 ч при комнатной температуре, концентрирования в вакууме, экстр агирования масла этилацетатом, промывки этого раствора, как обычно, раствором лимонной кислоты, бикарбоната калия и водой, сушки над сульфатом натрия и упаривания в вакууме получают масло. Выход 87 г (93% от теории).В. Дибензолсульфимидная соль глицил.- глутамин-трет.-бутилового сложного эфира.80 г бензилоксикароонил-глицил - 1.-глутамин-трет.-бутилового сложного эфира (п, Б) в 900 мл метанола деацилируют (60 г дибензолсульфимида) гидрогенолизом, как описано в п, А. Получают маслянистый остаток, который кристаллизуется при растирании с петролейным эфиром; т. пл. 92 С (с разложением), а= - 8,5 (с 1,0; метанол), Выход 110 г (98% от теории),Г. Бензилоксикарбонил - 1. - аспарагинилБе-трет. - бутилоксикарбонил.-лизин,51 г Хв-трет.-бутилоксикарбонил - 1.-лизина переводят в бензилтриэтиламмонийную соль и после этого перемешивают в 700 мл диметилформамида с 81 г бензилоксикарбонил.- аспарагин-нитрофенилового сложного эфира в присутствии 1 эквивалента пиридина в течение 48 ч при 20 С. Остаток после упаривания в вакууме одновременно обрабатывают этилацетатом и раствором бисульфата калия. Образующийся осадок отфильтровываюти перекристаллизовывают из этанола/петролейного эфира, т. пл, 174 - 175 С (с разложением); а" =+ 13,8 С (с 1,0; пиридин). Выход 70 г (71% от теории).Д, Бензилоксикарбонил - 1, - аспарагипилКе-трет.-бутилоксикарбонил-. - лизил - глицил.-глутамин - трет, - оутиловый сложный эфир,К 61,5 г дибснзолсульфимидной соли глицил. - глутамин - трет, - бутилового эфира и 54,5 г бензилоксикарбонил.-аспарагинилКе-трет.-бутилоксикарбонил - 1. - лизина в 700 мл диметилформамида добавляют при перемешивании при 0 С сначала 15,5 мл триэтиламина и через 15 мин по 13 г К-оксисукцинимида, и 23 г К,К-дициклогексилкарбодиимида. Реакционную смесь перемешивают 3 ч при 0 С, а затем еще 24 ч при комнатной температуре. Фильтрат упаривают в вакууме, остаток кристаллизуют пои обработке этилацетатом. Перекристаллизацию производят из метанола/воды и изопропанола/этилацетата, т. пл, 155 в 1 С; а 1 Р = - 20,8 (с 1,0; этанол). Выход 63 г (73% от теории). Е. Хлоргидрат .-аспарагинил-Кв - трет.- бутилоксикарбонил. - лизил - глицил - . - глутамин-трет.-бутилового эфира.47,5 г бензилоксикарбонил-аспарагинилКе-трет.-бутилоксикарбонил - 1. - лизил-глицил. - глутамин-трет.-бутилового эфира (по (п. Д) в 800 мл метанола гидрируют при статических условиях величины рН (рН=5,5;25,2 мл 2,5 н. раствора хлористого водорода в метаноле). Остаток после упаривания фильтрата в вакууме при растирании с диэтиловым эфиром дает бесцветный пороцок, т. пл. 98 С; а 1 =+9,5 (с 1,0; метанол).Выход 40 г (97%).Ж. Ка, Кб, Ко-трибензилоксикарбонил-.- аргинил-.-аспарагинил-Кв - трет. - бутилоксикарбонил.-лизил - глицил. - глутаминтрет.-бутиловый эфир.К 31,9 г хлоргидрата 1.-аспарагинил-Квтрет.-бутилоксикароонил - 1. - лизил - глицил.-глтамии - трет.-бутилового эфира (по п. Е) и 33,68 г Ка,КЬ,Ки-трибензилоксикарбонил.-аргинин-К-оксисукцинимидного эфира в 1 л диметилформамида добавляют при 0 С 7 мл триэтиламина и перемешивают 24 ч при 0 С, а затем при комнатной температуре; далее проводят упаривание в вакууме, переосаждение остатка из метанола/воды и затем перекристаллизация из метанола дают бесцветный порошок; а = - 7,6 (с 1,0; ледяная уксусная кислота). Выход 46,5 г(80% от теории).3, Дибромгидрат .-аргинил (бромгидрат)- 1.-аспарагинил-Кв-трет. - бутилоксикарбонил.-лизил-глицил - 1. - глутамин - трет.-бутилолого эфира,45,5 г Ка,КЬ,Ко-трибензилоксикарбонил-.- аргинил - 1.- аспарагпнил -Кв-трет, - бутилоксикарбонил.-лизил - глицил - 1. - глут 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 б 0 б 5 амин-трет.-бутилового эфира (по п. Ж) в1,5 л диметилформамида/метанола (2:1) деацилируют гидрогенолизом при статическихусловиях величины рН (рН=4.5; 80 мл 1 н,бромистоводородной кислоты). Упариваниефильтрата в вакууме и переосаждение остатка из этанола/диэтилового эфира дает аморфный порошок: а 1 д - 4,8 (с 1,0; 80%ная уксусная кислота). Выход 37 г (98% оттеории). Выход 55%/в пересчете на исходный(22 в)/; а 1 - 7,6.+1 (с 1,0; уксуснаякислота) .Продукт хроматографически однороден ви-бутаноле/ледяной уксусной кислоте/воде,3; 1: 1 и и-гептане/трет.-бутаноле/ледяной уксусной кислоте, 5: 1: 1,Вычислено, %: С 57,98; Н 6,69; К 13,29;0 22,02,Найдено, %: С 57,70; Н 6,56; К 13,29; 022,45.После удаления трех бензилоксикарбонильных защит каталитическим гидрогенолизомв присутствии двух эквивалентов бромистоговодорода получают требуемую фракцию 1(01 Вп) - ОМе(17) соединяют обычным способом в (16 - 17 а); щелочное омыление и последующее каталитическое деацилированиеприводят к получению Н - .уз (ВОС) - 01 ц -(0 Вп) .уз (ВОС) - 61 ц (01 Вп) - ОН (14 -17 а).Эксперимент осуществляют аналогичнопримеру 1.Выход 48% (в пересчете на исходныйН - 61 п (01 Вп) - ОМе (17); а = - 9,8-+1(аминокислоты 12 - 13) осуществляют аминоацилированием норлейцина (13) У - Агд(б,св - У) - 05 п (12). Выход 86%.Эксперимент проводят аналогично примеру 1, т. пл. 130 - 132 С; а =+7,2+1(аминокислоты 9 - 11). Синтезированный поизвестному способу дипептид Н - 1.ец - 61 п -ОН (10 - 11) связывают с Х - 61 п (01 Вц) -08 ц (9) и получают Х - 61 п (01 Вц) - 1.ец -6 п - ОН (9 - 11); выход 74 о/о.Эксперимент осуществляют аналогичнопримеру 1, т. пл. 146 - 148 С; а о(аминокислоты б - 8).Синтезированный по известному способудипептид Н-Туг (1 Вп) - 61 у - ОН (7 - 8) соединяют с Х - ТЬг (1 Вц) - ОЯц (б), получаютзащищенный трипептид (6 - 8 а), который дибензилоксикарбонилированием превращают втребуемый фрагмент Ч, а именно, Н - Тйг(1 Вп) - Туг (1 Вц) - 61 у - ОН (б - 8 в).Эксперимент осуш" ствляют аналогичнопримеру 1.Выход около 81% (в пересчете на исходный дипептид 7 - 8); т, пл. 126 - 127 С;а=+7,9-)-1 (с 1, метанол),Продукт хроматографически однороден втретичном амиловом спирте/пиридинс/воде,35: 35: 30,Вычислено, о/о. С 60,88; Н 8,30; К 8,88,Найдено, /о. С 60,69; Н 8,31; Х 8,91,Расчеты даны в пересчете на дипептид с1/4 мол. кристаллизационного этилацетата. П р и м е р б. Получение фрагмента И (аминокислоты 1 - 5).По указанному способу с карбодиимидом Х - Ле - ОН (4) соединяют с Н - Рйе - 01 Вц (5). После каталитического деацилирования промежуточного защищенного дипептида выделяют Н - Ле - Рйе - 01 Вц (4 - 5 в),Выход 90/о.ВОС - Ча - ОН (2 а) и Н - Рго - ОМе (За) по указанному фосфоразо-методу соединяют в защищенный дипептид (2 - За); последующее омыление дает ВОС - Ча - Рго - ОН (2 - Зв). Выход 70%. Дипептид (2 - Зв) получают еще реакцией ВОС - Ъа 1 - 05 ц (2 в) с двумя эквивалентами пролина (Зв). Выход 83%Оба производных дипептидов карбодиимидным методом соединяют в ВОС - Ча - Рго - Ле - Р 11 е - 01 Вц (2 - 5 а); обработка трифторуксусной кислотой (2 - 5 а) дает свободный тетрапептид Н - 1 а - Рго - Ле - РЬе - ОН (2 - 5 в), к которому присоединяют ВОС - РЬе - ОЯц (1) и получают ВОС - РЬе -- Ча - Рго- - Ле - Рзе - ОН (1 - 5 а) (фрагмент Ч 1),5 10 15 20 25 30 35 40 45 Эксперимент осуществляют аналогично примеру 1.Выход 63% /в пересчете на (4 - 5 в)/; т. пл,218 С; а " - 64,21 (с 1, уксусная кислота),Продукт хроматографически однороден ви-бутаноле/ледяной уксусной кислоте/воде,3:1:1 и третичном амиловом спирте/пиридипе/воде, 35: 35: 30.Вычислено, /о. С 64,88; Н 7,64; И 9,70,Найдено, % С 64,72; Н 7,70; М 9,61П р и м ер 7. Конденсация фрагментов1 - Ч 1 (общая последовательность 1 - 22).Фрагмент 11 (14 - 17 а) при помощи указанного способа с дициклогексилкарбодиимид-Моксисукцинимидом соединяют с фрагментом 1 (18 - 22 в), получают защищенный нонапептид (14 - 22 а), который каталитическимгидрогенолизом переводят в Н - Ип (01 Вп) -6 ц - (01 Вц) - 1.уз (ВОС - Ыц (01 Вц) - Агд(14 - 22 в) осуществляют тем же способом иполучают Х - Агд (б,а - Х) - И 1 е - 61 п (01 Вц)Ип (01 Вц) - 1.уз (ВОС) - 61 п (01 Вп) - Агд(12 - 22 а) Выход около 69% (в пересчете наисходный фрагмент 1); а = - 4,9-+1 (с 0,7;метанол) .Продукт хроматографически однородный ви-бутаноле /ледяной уксусной кислоте/воде,3: 1: 1 и и-гептане/третичном бутаноле/ледяной уксусной кислоте, 3: 2: 1.Вычислено, %. С 55,48; Н 7,29, И 12,82; 020,92; Вг 3,48.Найдено, %: С 55,24; Н 7,27; Х 12,62; 020,97; Вг 3,20.Каталитическим гидрогенолизом в присутствии бромистого водорода производного ундекапептида (12 - 22 а) удаляют бензилоксикароонильные защитные группы и получаютв виде бромгидрата Н - Агу (НВг) - Хе -Ып (01 Вп) - Иц (01 Вц) - 1.уз (ВОС) - Ыц(01 Вц) - Агд (НВг) - Азп - 1.уз (ВОС) -Сеу - Сз 1 п - 01 Вп (12 - 22 в),Конденсацию фрагмента 1 Ъ (9 - 11) с (12 - 22 в) проводят по указанному способу с дициклогексилкарбодиимид - И - оксибензтриазолом, После отщепления гидрогенолизом Х- защитной группы выделяют в чистом виде Н - 61 п (01 Вц) - 1.ец - 61 п - Агу (НВг) - Ме - 6 ц (01 Вп) - 61 ц (01 Вц) - 1.уз (ВОС) - 6 и (01 Вп) - Агд (НВг) - Азп - 1.уз (ВОС) - Ыу - 61 п - 01 Вц (9 - 22 в). Выход 77%, ад = - 6,3:Е 1 (с 0,7, метанол).Продукт хроматографически однороден в и-бутаноле/ледяной уксусной кислоте/воде, 3: 1:1.Вычислено, /о: С 47,99; Н 7,58; К 13,72, Найдено, %: С 47,81; Н 7,28; Ы 13,69.Аминокислотный анализ: 1.уз 1,99; Агд 1 98; Азр 1,03; 6 ц 6,30; 61 у 0,98; Ееп 0,97; К 1 е 1,01, 562193 10Фрагмент Ъ (6 - 8 а) соединяют с И-оксисукцинимидным эфиром фрагмента И (1 - 5 в). Однако нс удается получить соеинение (1 - 8) в чистом виде, а именно ВОС - Ре - Ча - Рго - Ле - Рйе - Тйг (Вц) - Туг (Вц) - 61 у - ОН. Аминокислотный анализ октапептида (1 - 8) показывает, что он загрязнен -10% (1 - 5 а или в); попытки разделения этой смеси безуспешны. Поэтому сырой фрагмент (1 - 8) соединяют с производным тетрадекапептида (9 - 22 в) вышеуказанным способом в ВОС - Рйе - Уа - Рго - 1 е - Рзе - Ттг (Вц) - Туг (Вц) - 6 у - 61 ц (0 Вц) - 1.ец - 61 п - Агд (НВг) - М 1 е - 61 ц (0 Вц) - 6 ц (0 Вц) - 1.уз (ВОС) - 61 ц (0 Вц) - Агд (НВг) - Азц - 1.уз (ВОС) - 61 у - 61 п - 0 Вц (1 - 22 а). После отщепления всех защитных групп действием безводной трифторуксусной кислоты и последующего отделения ионов трифторацетата и бромида ионообменной хроматографией на слабоосновной (в ацетатной форме) смоле Дауэкс 44, получают сырой 1.-норлейцин-мотилин (1 - 22 в), который загрязнен введением нечистого фрагмента (1 - 8).Экспериментальное осуществление конденсации фрагментов.А. Конденсация 1 с 11.9,2 г фрагмента 1 (по примеру 1), 9,36 г фрагмента 11 (по примеру 2) и 1,4 мл триэтиламина в 200 мл диметилформамида смешивают при 0 С с 2,3 г К-оксисукцпнимида и затем с 3,1 г И,К-дициклогексилкарбодиимида, Реакционную смесь перемешивают 24 ч при 5 С и 4 дня при комнатной температуре, фильтрат упаривают в вакууме. Остаток несколько раз отмывают водой и дважды пере- осаждают из метанола/этилацетата. Получают трет,-бутиловый эфир защищенного нонапептида в виде аморфного порошка, а) ", = = - 14,6 (с 1,0; диметилформамид). Выход 14,8 г (84% от теории).12,3 г полученного соединения в 800 мл метанола каталитически гидрируют при статических условиях величины рН (рН=5,5; 7 мл 1 н. бромистоводородной кислоты). Фильтрат упаривают в вакууме, остаток дважды пере- осаждают из этанола/этилацетата. Получают бромгидрат трет.-бутилового эфира 1. - глутамил (у-трет,-бутиловый эфир)-1. - глутамил (у-трет,-бутиловый эфир) -1 е-трет.-бутилоксикарбонил - 1. - лизил - 1. - глутамил, (у-трет.-бутиловый эфир) - 1. - аргинил(бромгидрат) - 1. - аспарагинил-Ие - трет.- бутилоксикарбонил. - лизил - глицил - тлутамина. а) = - 21,5 (с 1,0; метанол). Выход 11,4 г (96% от теории).Б, Конденсация (1 - 11) с 111,3,4 г производного нонапептида (по п, А), 2,8 г фрагмента П 1 (по примеру 3) в 200 мл диметилформамида и 0,70 г И-оксисукцинимида смешивают при - 10"С с 0,28 мл триэтиламина и затем с 0,.825 г Х,К-дициклогексилкарбодиимида. Смесь перемешивают и 15 20 25 30 53 40 45 50 55 бО б 5 24 ч при +4 С и 24 ч при комнатной температуре, После удаления растворителя в вакууме остаток персосаждают из метанола/ /этилацетата, затем промывают водой и еще раз переосаждают из метанола/этилацетата. Получают защищенный ндекапептид в виде аморфного порошка, я)= - 4,9 (с 0,7; метанол). Выход 3,9 г (85% от теории),3,5 г полученного производного ундекапептида в 800 мл метанола каталитически гидрируют при статических условиях величины рН (рН=4,5; 31 мл 0,2 н. раствора бромистого водорода в метаноле). Остаток из упаренного в вакууме фпльтрата переосаждают из метанола/этплапетата. Получают бромгидрат трет.-оутилового эфира 1.-аргинил.-норлейпил-глутамил (у-трет. - бутиловый эфир)- 1.-глутамил (у-трет.-бутпловый эфир) - Натрет.-бутилокспкарбонил - 1. - лизпл.-глутамил (у-трет.-бутпловый эфир) - 1. - аргинил.-аспарагинил-Хе-трет, - бутилоксикарбонил-лизил-глипил-глутамина в виде порошка. а)д = - 21,7 (с 1,0; метанол). Выход 3,0 г (95% .от теории),В. Конденсация (1 - 11 - 111) с 1 Ч.2,7 г производного ундекапептида (по п. Б).1,5 г фрагмента 1 Ч (по примеру 4) и 0,405 г 1-оксибензтриазола в 200 мл диметилформамида смешивают при 0 С с 0,182 мл триэтиламина и затем с 0,577 г К,ЬГ-дициклогексилкароодпимида. Реакционную смесь перемешивают 24 ч при 0 - 5 С и затем еще 5 дней при 25 С. Остаток после упаривания в вакууме переосаждают дважды из метанола/этилацетата, после высушивания в вакууме промывают водой и затем еще раз переосаждают из метанола/диэтилового эфира. Получают защищенный тетрадекапептид (1 - 11 - 111 - 1 Ч) в виде аморфного порошка. а) = - 4,3 (с 0,7; метанол). Выход 2,7 г (82% от теории).2,0 г полученного производного тетрадекапептида в 800 мл метанола каталитически гидрируют при постоянном значении рН (рН 4,5; 8 мл 0,1 н. бромистоводородной кислоты). Остаток после упаривания фильтрата переосаждают из метанола/этилацетата.Получают тетрабромгидрат трет.-бутилового эфира 1.-глутамил (у-трет.-бутиловый эфир)-1.-лейцил.-глутамил - 1. - аргинил. - норлейцил.-глутамил (у - трет.-бутиловый эфир)-1.-глутамил (у-трет, - бутиловый эфир)- Хе-трет.-бутилоксикарбонил - 1. - лизил - 1.- глутамил (у-трет.-бутиловый эфир) - 1. - аргинил.-аспарагинил-Хе-трет. - бутилоксикарбонил.-лизил-глицил - 1. - глутамина в виде аморфного порошка, а) = - 6,3 (с 0,7; метанол). Выход 1,82 г (94% от теории).Г. Конденсация 7 с У 1.21,6 г фрагмента И и 6,9 г Х-оксисукцин. имида в 400 мл диметилформамида смешивают при - 5 С с 6,3 г М,Х-дициклогексилкарбодиимида, реакционную смесь перемешивают 2 ч при 0 С и в течение 10 - 15 ч при комнатной температуре. Фильтрат упаривают в ва562193 кууме. Маслянистый остаток кристаллизуют из изопропанола. Получают трет.-бутилоксикарбонил.-фенилаланил - 1.-валил-пролил.-изолейцил. - фенилаланин - М - оксисукцинимидный эфир, т. пл. 190 - 192 С; аа +59,28 (с 1,0; диоксан). Выход 21,3 г (88% от теории) . 12,2 г фрагмента Ч и 3,8 мл триэтиламина в 400 мл диметилформамида смешивают с 14,8 г полученного Х-оксисукцинимидного эфира, реакционную смесь после перемешивания в течение 24 ч при комнатной температуре упаривают,в вакууме, маслянистый остаток растворяют в этилацетате и растворе лимонной кислоты. Этилацетатный слой промывают, как обычно, сушат и упаривают в вакууме досуха. Из этилацетата/петролейного эфира получают бесцветные кристаллы трет.- бутилоксикарбонил. - фенилаланил.-валил.-пролил.-изолейцил - 1. - фенилаланил- трет.-бутил. - треонил-О-трет. - бутил - 1.- тирозил-глицина. к 1 =44,0 (с 1, этанол). Выход 18,2 г (87% от теории). 25 Таблица 1 Д. Конденсация (1 - 11 - 111 - 1 Ч) с (Ч - Ъ 1).1,3 г производного тетрадекапептида (по и. В), 1,17 г защищенного октапептида (по п. Г), 0,07 мл триэтиламина и 0,175 г М-оксисукцинимида (или 0,20 г оксибензтриазола) в 100 мл диметилформамида смешивают при ( - 10 С) с 0,257 г М,Х-дициклогексилкарбодиимида. Смесь перемешивают 2 дня при 0 С и 3 дня при комнатной температуре. После удаления растворителя в вакууме остаток тщательно растирают с горячим этилацетатом, смолистый продукт переосаждают из метанола/этилацетата, сушат после растирания с этилацетатом и затем 5 ч тщательно обрабатывают,водой. После переосаждения из метанола/воды получают аморфный порошок (1,1 г) защищенного докозапептида (1 - 11 - 111 - 1 Ч - Ч - И) .0,2 г полученного продукта заливают 20 мл ледяной трифторуксусной кислоты и выдерживают 2 ч при комнатной температуре, Избыток трифторуксусной кислоты удаляют в вакууме по возможности при низкой температуре, остаток растворяют в разбавленной уксусной кислоте, полученный раствор дваж. ды обрабатывают 4 г слабоосновной анионообменной смолы в ОН - форме, после чего элюат подвергают лиофилизации, Выход 157 мг фракция Вычисленное отношение для Л-норлейцин-мотилина30 35 40 45 2,04 1,99 1,01 6,00 0,91 1,06 0,880,86 0,99 1,00 1,73 50 55 60 65 П р и м е р 8. Получение синтетического продукта в чистом, виде.А. Проводят ионообменную хроматографию 25 мг полученного сырого 1.-норлейцин-мотилина на существующей в ацетатной форме, сильноосновной анионообменной смоле ЯАЕ-Сефадекс А.Экспериментальные условия:колонна ЗОБО,9 см; 25 мг продукта, растворенного в 2 мл 0,5%-ного аммиака; 5 10 15 20 12система: 0,025 М раствор ацетата аммония (доведенного разбавленным аммиаком до р Н =9,27),скорость потока 18 мл/ч; фракции по 6 мл, Производят разделение на две основные фракции В 1 и В.Фракция В (около 4 мг) является ожидаемой неправильной последовательностью (1 - 5/9 - 22), фракция В, (около 12 мг) является искомым 1.-норлейцин-мотилином. Полученный сушкой,вымораживанием в твердой фазе докозапептид оказывается однородным в системе: н-бутанол/ледяная уксусная кислота/вода/пиридин, 30: 6: 24: 20 и н-бутанол/ледяная уксусная кислота/вода/пиридин, 30: 12: : 24: 20, как при хроматографии на бумаге, так и при тонкослойном хроматографировании.Аминокислотный анализ фракций В и В, проводят после кислотного гидролиза (6 н. НС 1, 20 ч), причем оказывается, что при гидролизе в течение 72 ч получают практически одинаковые величины (табл. 1). 1,98 1,98 1,00 1,00 6,08 0,97 1,99 0,94 0,95 1,00 1,01 0,91 1,82 Биологическая активность высу шенной вымораживанием фракции В 1 50%, Опыты по фер ментативному гидролизу подтверждают предложенную первичную структуру.Б. Указанную в п. А методику очистки повторяют с применением следующих экспериментальных условий:колонна 80 Р,1,5 см;235 мг. сырого продукта, растворенного в 15 мл 0,5%-ного аммиака, подают на уравновешенную 0,025 М раствором ацетата аммония (доведенного разбавленным аммиаком до рН=9,20) колонну;растворитель: 0,025 М раствор ацетата аммония (рН 9,20);скорость потока: 47 мл/ч; фракции по 23,5 мл, распределение пептида определяют измерением экстинкции при 220 нм.(12) (Д) (19) (15) (16) (17) (15) (В) (20) (Л) (2 У) глутампл (Т-трет.-бутиловый эфир) - лейцил.глутамин (аминокислоты 9 - 11),фрагмент К - О-трет.-бутпл-треонпл-О-трет.- бутил-тирозил-глицпн (аминокислоты 6 - 8),ЗО фрагмент И - Ха-трет,-бутилоксикарбонил-фенилаланил - валил-пролил - изолейцил-фенилаланин (аминокислоты 1 - 5);синтезированные фрагменты 1 - И конденсируют друг с другом известным способом,35 например, модифицированным карсюдиимидным, на основе дицпклогексилкарбодиимидФоксисукцинимида; с полученного производного полипептида (1 - 22) удаляют защитныегруппы действием трифторуксусной кислоты с40 последующим выделением целевого продуктаизвестным способом. Составитель Л. Волкова Техред И. Позняковская Редактор Т. Девятко Корректор Л. Брахнина Заказ 2798/11 Изд Ло 520 Тираж 650 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская иаб., д. 4/5Типография, пр. Сапунова, 2 13Осуществляют разделение на две фракции В, (135 мг) и Вз (44 мг), весовые данные относятся к подвергнутым лиофилизации фракциям.В. Для дальнейшей очистки,135 мг фракции В обрабатывают хроматографией на колонне на существующей в аммонийной форме сильнокислой катионообменной смоле 8 Р-Сефадекс С,Экспериментальные условия следующие: колонна 80 К 1,5 см; растворитель: 10 мл 0,5% -ная уксусная кислота; система; 1 - 0,025 М раствор ацетата аммония, полученный из 0,025 М уксусной кислоты добавлением разбавленного раствора аммиака до рН 5,0;2 - 0,025 М раствор ацетата аммония (рН =5,38); скорость потока; 110 мл/ч; фракции по 37 мл.Получают две основные фракции, а именно С (57 мг) и С 2 (48 мг).,Фракция С 2 биологически неактивна, фракция С, показывает биологическую активность выше 90% по сравнению с природным мотил ином.Результаты проведенных ам иноки слотных анализов приводятся в табл. 2. о т л и ч а ю щ и й с я тем, что получают отдельные защищенные фрагменты;фрагмент 1-аргинил- (бромтидрат) - аспарагинил-Хв-трет. - бутилоксикарбонил - лизилглицил-глутамин - трет.-бутиловый эфир (аминокислоты 18 - 22),фрагмент 11 - Ка-бензилоксикарбонилглутамил-(у-трет.-бутиловый эфир) -глутамил(у-трет.-бутиловый эфир) -Ив-трет.-бутилоксикарбонил-лизил-глутаминовая кислота (утрет. - бутиловый эфир (аминокислоты 14 - 17),фрагмент 111 - Ма, Иб, Хо-три(бензилоксикарбонил) - аргинил - норлейцин (аминокислоты 12 - 13),фрагмент 1 Ч - Ха-бензилоксикарбонил 1,99 2,03 1,00 1,00 6,08 0,99 2,02 0,95 0,95 1,00 0,99 0,9192 1,98 1,96 1,03 1,00 6,14 1,05 2,08 0,91 0,90 1,00 1,00 1,91 1,91