Способ получения авермектина в

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 18 О 61 у 8 ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ ПАТЕНТ 2УЧЕНИЯ АВЕР)ч)ЕКТИ 4) СПОСОАВ,где пунктирная линия и можную двойную связь; йс - гидрокси, присут дэ, когда отсутствует дво В 2 - 4-(альфа-олеа олеандрозилокси формулставляет возИзвестные 31267, АТСС 31 ют натуральные формулы (1),цтаммы Я,ачегв 1 с 111 з АТ 71, АТСС 31272 продуци авермектины - соединен ствует только т ная связь, дрозил)-альфаы (11) ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОВЕДОМСТВО СССР(72) Эдмунд Вилльям Хэфнер (ОЯ) КелвинСкотт Холдом (ОВ) и Шин-Джен Эдвард Ли(56) Патент США %4310519, кл. А 61 К 31/71,1982.Патент Великобритании Ъ 4429042,кл. А 61 К 31/71, 1983.Патент СССР М 1560059,кл, С 12 Р 17/08, 1986,Изобретение относится к биотехнолоии и касается производства антибиотика вермектина, обладающего противопаразиарной активностью. Известны с ных авермекти штаммов-про ачегв 1 с 111 з АТС 31272 в жидкой сутствии карбо условиях. Посл цента производ дуктов. пособы получения производна путем культивирования дуцентов Ясгерсовусез С.,М 31267 или 31271, или питательной среде в приновых кислот в аэробных е культивирования продуят выделение целевых про 5 с)5 С 12 Р 17/08//(С 12 Р 17/08. С 12 й 1:465)(57) Область использования: микробиологическая промышленность, производство антибиотиков. Сущность изобретения: авермектины В получают при культивировании штамма Ясгерсовуцз ачегв 1 с 111 з АТСС М 53692 в питательной среде в присутствии карбоновой кислоты. Используемый штамм является двойным мутантом с отсутствием разветвленно-оксокислотнодегидрогеназной и В-авермектин-О-метилтрансферазной активностей, Полученные авермектины В обладают противопаразитарной активностью широкого спектра действия, 1 з.п,ф-лы,либо во время инокуляции, либо через некоторые промежутки времени во время ферментации, Продуцирование авермектиновых продуктов можно контролировать путем отбора проб из ферментационной среды, проводя экстрагирование органическим растворителем с последующим определением продукта методом хроматографии, например, используя жидкостную хроматографию высокого давления, Инкубацию проводятдо тех пор, пока выход продукта не будет максимальным, в общем в течение 4-15 дней,Предпочтительное количество затравочных соединений в каждом случае добавления (карбоновая кислота или соединение, превращающееся в нее) составляет 0,05- 3,0 г на 1 л, Затравочное соединение можно добавлять в ферментационную среду непрерывно, через некоторые промежуткивремени или однократно, Кислоту (ВСООН) добавляют как таковую или в виде соли кислоты, такой как соль натриевая, литиевая или аммониевая, или как соединение, превращающееся в кислоту. Кислоту, если она существует в виде твердых частиц, по предпочтительному варианту растворяют в подходящем растворителе, таком как вода или (С 1-С 4)-спирты,Среды, которые используют для ферментации, могут представлять собой, в особенности когда Сзаместителем является изопропил или (Я)-втор,бутил, общепринятые среды, содержащие усваиваемые источники углерода, азота и следы элементов. Когда С-заместитель-ненатуральная группа, т.е. она не является изопропилом или (3)-втор, бутилом, то ферментационная среда является такой, в которой выбранные ингредиенты не содержат или содержат только минимальные количества затравочных соединений, в которых В-изопропил или (Я)-втор, бутил.После ферментации в течение нескольких дней при температуре предпочтительно в интервале 24-33 С ферментационный бульон центрифугируют или фильтруют, и мицелиевый осадок экстрагируют, предпочтительно ацетоном или метанолом. Экстракт в растворитель концентрируют, в целевой продукт затем экстрагируют в не смешивающийся с водой органический растворитель, такой как хлористый метилен, этилацетат, хлороформ, бутенол или метилизобулкетон. Экстракт в растворителе концентрируют, и сырой продукт далее очищают до необходимой степени хроматографией, например, используя препаративную хроматографию с обращенной фазой, жидкостную хроматографию высокого давления.50 Продукт обычно получают в виде смесисоединений формулы , где В 2-4-(альфа. -олеандрозил)-альфа-:олеандрозилокси, В 1- ОН, и двойная связь отсутствует, или5 отсутствует В 1, а двойная связь присутствует, и где Вз-Н. Соединения, в которых Вз-СНз,по-существу, отсутствуют. Однако пропорции каждого соединения могут соединятьсяв зависимости от использованного конкрет 10 ного мутанта и затравочного соединения, атакже условий проведения,Источники группы В, т.е, то, происходитли она непосредственно от В-ООН, или ееполучают из одного из упомянутых пред 15 шественников; или из любого предшественника, не является существенным дляполучения авермектинов, Существеннымтребованием для процесса согласно изобретению для их получения является то, что 20 бы нужная группа В была доступнаштаммам 51 г.ачеггп 1 йз согласно изобретению в процессе ферментации.Подходящими являются следующие соединения,25 2,3 - диметилмасляная кислота;2 - метилгексановая кислота;2 - метилпент-еноевая кислота;2 - циклопропилпропионовая кислота;литиевая соль 4,4-дифторциклогексан 30 карбоновой кислоты;4 - метиленциклогексанкарбоноваякислота;3 - метилциклогексанкарбоновая кислота (цис/транс);35 1 - циклопентенкарбоновая кислота;1 - циклогексенкарбоновая кислота;тетрагидропиран - 4-карбоновая кислота;тиофен - 2-карбоновая кислота;40 3 - фурокислота;2 - хлортиофен-карбоновая кислота;циклобутанкарбоновая кислота;циклопентанкарбоновая кислота;1806198 5 10 15 40 50 55 3-фторциклобутанкарбоновая кислота;литиевая соль 3-метилленциклобутанкарбоновой кислоты;2-метил-метилтиомасляная кислота;тетрагидротиопиран-карбоновая кислота;циклобутилметиламин;этилциклобутанкарбоксилат;4-гидроксиметилциклопентен;этиловый эфир 2-(3-тиофенкарбонил) пропиойовой кислоты;8-2-метилпентановая кислота; й-метилпентановая кислота,Изобретение иллюстрируется следующими примерами.П р и м е р 1. Получение двойного мутанта Зт.ачеппЮИз 7881 (АТСС 53692) с недостающими разветвленно-оксокислотодегидрогеназой и В-авермектин-метилтрансферазой.Стадия 1. Исходный штамм 81 г. ачеппЮИз АТСС 53567 выращивают в виде сливного слоя на агаре "йев Ра 1 сЬ, Айаг" в течение 12 дней при 30 С;Споры собирают с трех таких чашек и суспендируют в 20 мл 0,05 М трис-малеинокислотном буфере, рН 9.Среда "йеа РассЬ,Ацаг" имеет следующий составЧ - сок ) 200 млСаСОз ЗгАгар 15 гН 20 . до 1000 млПитательный бульон 1,0 г/лАцетат натрия ЗН 20 1,4 гМИзовалериа новая кислота 50 мг/лИзомасляная кислота 50 мг/лМетилмасляная кислота ЬО мг/лИзолейцин 250 мг/лЛейцин 250 мг/лВалин 250 мг/лРаствор микроэлементов1 мл/л) Смесь.из 8 растительных соков (помидоры, морковь, сельдерей, свекла, петрушка, латук, горчица и шпинат) плюс соль, аскорбиновая и лимонная кислота и натуральные вкусовые добавки.Состав раствора микроэлементов: ГеОз 6 Н 20 2,7 гМп 804 Н 20 4,2С 0 304 5 Н 20 0,5Са С 2110Н 2 РОз 0,62СаС 2 6 НгО 0,242 пС 2 0,62йа 2 Мо 04 0,24 Вышеупомянутое растворяют в 1 л 0,1 НС,Стадия 2. 10 мл споровой суспензии добавляют в ампулу, содержащую 10 мг й-метил-й-нитро-й- нитрозогуанидина (НТГ), Ампулу инкубируют на шейкере при 28 С 60 мин, затем тщательно промывают раствором 1% йаС;Стадия 3. Промытые споры суспендируют в 1 растворе йаС и смешивают с равным обьемом 80 этиленгликоля Суспензию хранят при -20 С и используют в качестве источника клеток для скрининга мутантов. Эту споровую концентрированную массу распределяют по чашке УРД (дрожжевой пептидно-декстрозный агар) для получения около 100 колоний на чашку, Колонии 20 мутагенизированой. популяции (обработанной нитрозогуанидином) исходного 31 г.ачеппЮИз АТСС 535567 собирают и наносят в виде мазков на агаровую среду, полученную следующим образом (граммы на литр);25 разбавленный крахмал 80,К 2 НРОа 1,МЯЗО 4 7 Н 20 1, ардамин рН 5, СаСОз 5, Р 1 мл, Ге 30 а 7 Н 20 0,01; МпСЬ 4 Н 20 .0,001, 2 п 804 7 Н 20 0,001; бактоагар 17, дистиллированная вода до 980 мл, рН среды 30 добавляют до 7, добавляя йаОН перед автоклавированием при 121 С в течение 20 мин.После автоклавирования добавляют 20 мл 5 концентрированного раствора (+)-2-метилмасляной кислоты, рН 7.35 Агаровые культуры инкубируют в течение 8-12 дней при 280 С. Клетки (мицелий) удаляют с поверхности агара, помещают в 250 млк ацетона. 25 мкл ацетоновых экстрактов затем наносят точками на хроматографические пластины "Апа 1 есп 8 Иса бе ОГ",Храмотограмму снимают в течение 30- 40 мин этилацетатом в качестве растворителя, затем сушат, затем обрабатывают 5 аанилином в этаноле. Пластины помещают в печь при 100"С на 1-3 мин, затем обрабатывают 30/ серной кислотой в этаноле и вновь помещают в печь при 100 С на 10-15 мин. Мутанты, лишенные В-авермектин-Ометилтрансферазы, идентифицируют по . изменению на хроматограмме: по присутствию пятна, соответствующего В-авермектиновым компонентам (Ю 0,54; 0,42 для В 1 и В 2 соответственно) и отсутствию пятна, соответствующего А-авермектиновым компонентам (В 1 - 0,69; 0,58 для А 1 и А 2 соответственно),Общие методики высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).Подвижная фаза: 150 мл воды, 70 млацетонитрила, добавляли метанол до получения объема 1 л.Колонка, типа "ОИга ЯрЬега" ОДЯ 25 см(ВесКвап пзсгив, Фуллертон, СА 92634- 53100),Поток: 0,75 мл/мин.Детектирование: УФ на 24, нм,Ослабление: около 6.Разбавитель образца (О): 35 мл ацетонитрила плюс 390 мл метанола.Стандарты 0,5 мг авермектина А 2 А вколбу емкостью 10 мл и довести метаноломдо нужного объема, навесить 0,5 мг испытуемого продукта в колбу емкостью 10 мл идовести до полного объема метанол.Они представляют собой стандартныеконцентрированные растворы: для стандартного раствора:взять 100 мкл и 100 мкл в ампулу идобавить 800 мкл подвижной фазы.Пробы: отобрать 1 мл хорошо перемешанного бульона; удалить возможно больше надосадочной жидкости, не затративаяосадок; добавить 100 мкл воды после высокоэффективной хроматографии к осажденному слою и провести вихревое смешиваниедля диспергирования; добавить 2 мл разбавителя и тщательно перемешать, профильтровать и подвергнуть высокоэффективнойжидкостной хроматографии,Натуральные и ненатуральные авермектины по изобретению подвергают высокоэффективной жидкостной хроматографии ивремя удерживания для пиков отдельныхавермектинов делят на время удерживаниядля наблюдаемого присутствующего олигомицина-А, служащего в качестве внутренне,го стандарта для данного определенияметодом БЗЖХ. Олигомицин-А почти всегданаблюдают с помощью высокоэффективнойжидкостной хроматографии в виде побочного продукта ферментации Ятг,ачегв 1 з и 45он является единственным продуктом, наблюдаемым с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, которыйпродуцируется описываемыми мутантами,когда их культивируют в среде, свободной 50от кислот ВСООН, где В имеет определенное значение, Обычно олигомицин-А имеетвремя удерживания 12,5-14 мин. Отношение удерживания (НУ) является более значимой основой длл идентификационного 55сопоставления и сравнения выходов авермектиновых продуктов, Общий порядок появления авермектиновых продуктов привысокоэффективной тонкослойной хроматографии - В 2, А 2, В 1 и А 1, Натуральныйавермектин Время удерживания/ Время удерживания (олигомицин А) В 2 в В 2 а А 2 в А 2 А В 1 в В 1 А А 1 в А 1 а 070 0,84 0,90 1,09 1,40 1,83 1,83 2,42 Ненатуральные авермектиныВремя удерживания/ Время удерживания (олиг.омицин А) циклопентил В 2 0,94циклопентил А 2 1,23циклопентил В 1 . 1,99циклопентил А 1 2,62Время удерживания колеблется в пределах 1-2 мин в разные дни, причем времяудерживания олигомицина А, по-видимому,составляет 12,5-15 мин,В следующих примерах авермектиныопределяют с помощью описанной процедуры высокоэффективной жидкостной хроматографии, за исключением случаев,которые оговорены особо,Составы использованных сред в следующих примерах представлены ниже,Среда А 7 г/лРазбавленныйкрахмал 20"Фармамедиа" с 15СаСОз 2,а приготовленный гидролизом крахмала альфаамилазной из Вас цз Оеп 1 огвз (продуктфирмы) "Иочо Епгув", Уилтон, КТ, поставляется под товарным знаком "Тегваву" додекстрозного эквивалента 40% й 5%,аот Уеаз + РгосистзпсКлифтон, Н,Дж07012сот Тгадегз Рго 1 еи, Мемфис, Теннеси 38108Добавляли КаОН, рН доводили до. 7,2Среда АР - 5 г/лразбавленныйкрахмал 801806198 12 7,45 14,72 12,9 27,9 14,85 32,26 12,43 26,23 3-Тиен слоожении 22-23 ойную связь, только тогда, язь, Й 2-4"(аль- еандрозилок 13,79 14,13 14,7 22,2 3-Фуранкарб вая кислота 2-Тиеновая к 2-Метилпентвая кислота слота -ено ХпЗОа 7 Н 20 0,001Р(противовспенивэтель) 1 мл/лпроизводство "Тпе Ооа Спевса Со", Мидланд, Мичиган 48640 добавляли 25 5 йаОН, доводили рН до 6,9.П р и м е р 2. Получение циклогексилавермектинов.Замороженную ампулу с культурой Зю. ачегв 1 т 1 з АТСС 53692 инокулируют в 10 100 мл среды АЯв колбе на 500 мл с тремя перегородками. Колбу инкубируют нэ вращающемся вибраторе со скоростью вращения 200 об/мин при 28-30 ОС. Через 28 чинкубации 5 мл цельного бульона инокули руют в 100 мл среды АЯили колбу с тремя перегородками емкостью 500 мл. Колбу снова инкубируют на вращающемся вибраторе со скоростью вращения 200 об/мин при 28- 30 С. Через 24 ч инкубации 21 мл бульона 20 инокулируют в колбу емкостью 300 мл, содержащую 40 мл среды АР, Колбы инкубируют при 28-30 С и 200 аб/мин. Через 24 ч добавляют 400 ррм циклогексанкарбоновой кислоты, через 312 ч отбирают пробы 25 по 2 мл и подвергают их высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано в примере 1. В этих условиях единственными авермектиновыми компонентами, об-наруженными в ферментационной среде, 30 были элюированные при 14,84 (54,9 мг/л) и 31,46 (32,1 мг/л) мин, что соответствует циклогексилу В 2 и В 1 соответственно.П р и м е р 3. Получение втор,бутилвермектинов, 35Воспроизводят усилия примера 2, но используют 400 ррм+2 метилмасляной кислоты вместо циклогексанкарбоновой кислоты, все остальные условия были такими же как и те, которые описаны в примере 40 2. Только втор. бутилавермектин В 2 (11, 60, 12, 40 мин, 63,5 и 42,4 мгл), и втор.бутилавермектин В 1 (23,1 мин, 105,5 мгл) были обнаружены в ферментационной среде.П р и м е р 4. Воспроизводят условия 45 примера 2, но с использованием 400 ррм каждого из указанных соединений. Время удерживания полученных авермектинов указано ниже.Соединение Время удерживания авермектина мин Вг . В 1 Метилтиомолочнаякислота 7,9 13,534-Тетрагидропиранкарбоновая кислота4-Метокси-метилмасляная кислота 8,72 17.,393-Циклогексенкарбоновая кислота4-Тетрагидротиопиранкарбоновая кислота 11,0 22,763-Тетрагидротиофенкарбоновая кислота 8,97 17,964,4-дифторциклогексанкарбоновая кислота2-Циклопентенкарбоновэя кислота 12,43 26,231-Циклопентенкарбоновая кислота1-Циклогексенкарбоновая кислота 15,24 33,234-Экзометиленциклогексанкарбоноваякислота 153 3412-Фуранкарбоноваякислота 7,82 15,312-Тетрагидрофуранкарбоновая кислота 6,16 11,62Соединения согласно изобретению являются высокоэффективными противопаразитными агентами, которые используют как противоглистные средства, зктопаразитициды, инсектициды и акарициды,Ф о р мул а и зо бр е те н ия 1, Способ получения авермектина Вформулы де прерывистая линия в по редставляет возможную д й 1-гидрокси и присутствует огда отсутствует двойная с фа:олеандрозил)-альфа:о и формулы1806198 НО СНО СН 5 Составитель В, РомановТехред М.Моргентал Редактор 3. Ходаков Корректор Л, Филь аказ 966 ВНИИПИ Государ Тираж Подписноетвенного комитета по изобретениям и открытиям 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 и ГКНТ ССС изводственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 10 где В-альфа-разветвленный Сз-Са-алкил, алкенил, алкинил, алкоксиалкил или алкилтиоалкильная группа, в которой алкильная группа представляет собой альфа-разветв ленную Сэ-Са-алкильную группу, Сз-Са-циклоалкильную или С 5-Са-циклоалкетильную группу, любая из которых может быть необязательно замещена метиленовой одной или более С 1-С 4-алкильными группами или 15 атомами галогена путем культивирования в азробных условиях продуцента вида Ятгерсотусез ачегтЮ 11 з в водной среде, содержащей усваиваемый источник азота, углерода и неорганических солей в присутствии карбоновой кислоты ВСООН. где В имеет указанные значения, и выделения целевого продукта, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, в качестве продуцентэ используют штамм Ятг,ачегв 1 т 11 3 АТСС 53692. а культивирование проводят и ри 28-30 С.2, Способ поп,1,отличающийся тем, что В 3-6-членное кислород- или серу- содержащее гетероциклическое кольцо, которое может быть насыщенным или полностью или частично ненасыщенным.