Способ выделения витамина в

(19) (1 ГОСУДАРСТВЕННЫЙПО ИЗОБРЕТЕНИЯМПРИ ГКНТ СССР ОМИТЕТОТКР ЫТИ НИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ В версиыи у доины - Вильнюс. Я ВИТАМИНА бретение относится кохимии и физхимии,мик час био ости мина В 12 в.результате нной экстракции,денных способов вызаключаются в дорония и реактивов, истки, дороговизне итательных сред для ганизмов, необходизатрат для проведепо техническои сущвыделения витамина материала. заключаки микроорганизмов. ны,отделяют от культем центрифугироваобьемами воды и в ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕ(57) Изогии, би Изобретение относится к микробиологии, биохимии и физхимии, в частности к способу выделения витамина В 12 из клеток пропионовокислых бактерий - промышленных продуцентов витамина В 12.Известны способы получения витамина В 12, заключающиеся: в фотохимическом преобразовании кофермента В 12 или оксикобаламина и их алкильных производных в витамин В 12; в аэробной ферментации артробактерий с последующим выделением из биомассы в результате гидролиза и фенольно-хлороформенной экстракции витамина В 12; в выделении и очистке витамина В 12 на ионообменной смоле, содержащей сополи- . мердивинилбензола и стирала; в кислотном гидролизе бактериальной массы с последу 12 Р 19/42, С 07 Н 23 способу выделения витамина 812 из клеток пропионовокислых бактерий. Цель изобретения - увеличение выхода витамина и упрощение способа. Способ выделения витамина В 12 включает культивирование пропионовокислых бактерий, отделение культуральной жидкости, обработку биомассы для разрушения клеток, экстракцию фенол-хлороформенной смесью и получение готового продукта, при этом перед экстрагированием клетки обрабатывают 0,5-3;4-ным раствором анионного детергента додецилсульфата натрия в щелочной среде при рН 9 - 10 в течение 30 мин. Обработку биомассы осуществляют путем замораживания клеток при температуре (-4)+12 С) и выдержки в течение 1 ч с последующим оттаиванием. 1 з.п. ф-лы, 3 табл. ющим выделением вита фенольно-хлороформеНедостатки приве деления витамина ВГ 2 говизне оборудова применяемых для оч многокомпонентных и выращивания микроор мости энергетических ния гидролиза,Наиболее близким ности является способ В 12 из биологического ющийся в том. что клет содержащие кобалами туральной жидкости пу ния, заливают 5 - 6течение 5 - 10 мин автоклавируют при рН4-5 в присутствии 4 мг КСМ. После центрифугирования супернатант подщелачиваютдо рН 8-9, к немудобавляют 4 мгКСМи выдерживают в темноте в течение 1 чдля перевода кобаламина в дициамидную форму. Их извлекают путем многократной экстракции небольшими порциямифенол-хлороформенной смеси (1:1). Из смеси кобаламины переводят в воду при добавлении 1.5 объема хлороформа и 0,75 обьеман-бутанола. Следы хлороформа и бутанолаудаляют посредством обработки содержимого этиловым эфиром, Концентрацию кобаламинов в водном растворе определяютспектрофотометрически,Недостатком известного способа является громоздкость, длительность самоготехнологического процесса выделения витамина 812, требующего использования дополнительного оборудования и затратэлектроэнергии (автоклавирование), многократность экстракции, ведущая к продолжительному процессу получения продукта.Кроме того, недостатком способа являетсянизкй Выход Витамина 812 В связи с тем,что зкстракция Фенол-хлороформеннойсмесью не ведет к полному извлечению витамина 812. Невысокий выход витамина 812получается в результате количественныхего потерь при термической денатурации,Цель изобретения - увеличение выходаВитамина и упрощение способа.Поставленная цель достигается тем, чтосогласно способу, включающему культивирование пропионовокислых бактерий, отделение культуральной жидкости отбиомассы, обработку биомассы для разрушения клеток, экстракцию фенол-хлорофор.менной смесью и получение готовогопродукта, перед экстрагированием разрушенные клетки обрабатывают 0,5-3 -нымраствором анионного детергента додецилсульфата натрия в щелочной среде при рН9-10 на протяжении 0,5 ч.Кроме того, разрушение клеток осуществляется путем замораживания ихпри температуре (-4)+12) С и выдержкой в течение 1 ч с последующим оттаиванием.Предлагаемый способ отличается от известного совокупностью признаков: обработ ка 0,5 - 3 -ны м раствором ан ион ногодетергента додецилсульфата натрия при рН9-10 в течение 0,5 ч; для разрушения клетокиспользуют процесс замораживания притемпературе(-4)+12) С и выдержку в тече-,ние 1 ч с последующим оттаиванием,Широкое применение в микробиологических экспериментах, связанных с извле 5 10 15 20 25 30 35 40 50 чением и солюбилизацией гидрофобных и встроенных в структуру бактериальных клеток белков, тейхоевых кислот, липидов и липополисахаридов нашли детергенты. В основе солюбилизирующего действия детергентов лежит их амфифильная природа, позволяющая им взаимодействовать и с гидрофобными и гидрофильными участками белков, либо других соединений, обладающих амфипатическими свойствами, В ряде случаев поверхностно-активные вещества выступают в качестве специфических экстрагирующих реагентов.Известно, что обработка детергентами вызывает диспергирование клеточных стенок, нарушение целостности наружных слоев клетки, увеличение проницаемости, раэрыхление и обезвоживание клеточной стенки вплоть до полного или частичного растворения и выхода внутриклеточного содержимого в среду. Но ни один из используемых детергентов не образует комплексного соединения с кобаламином,Однако неизвестно, что именно РОСйа вызывает специфическую солюбилизацию витамина 812 из клеток бактерий,Итак, предложено испольэовать в качестве детергента додецилсульфат натрия, вызывая специфическую солюбилизацию витамина 812 из клеток бактерий.В основе обнаруженного явления может лежать специфичность взаимодействия отрицательно зарякеного неорганического фрагмента молекулы детергента с положительно заряженным атомом кобальта в молекуле витамина 812, что не исключает и других вероятных механизмов. Пропионовокислые бактерии синтезируют кроме витамина 812 такие соединения, как флавины, менахиноны, цитохромы, порфирины и т.д. Однако после обработки клеток ОООНа в щелочной среде. из бактерии выходит витамин 812. а не какое-либо иэ перечисленных соединений. Даже в специальной литературе, посвященной способам разрушения бактерий, нет сведений о применении ООСМа для дезинтеграции клеток при щелочных рН. как наиболее эффективном методическом подходе.П ри щелоч н ых значениях рН ( 9 или 10) изменяется поверхностный заряд клеток бактерий, что позволяет алкильным частям молекул ООС 1 ча взаимодействовать с гидрофобными участками клеточных стенок бактерий и приводит к их дезинтеграции. В результате взаимодействия щелочного раствора ООСКа с суспензией бактериальных клеток при перемешивании окончательное значение величины рН становится нейтральным., что в свою очередь обуславливает стабильность выхода витамина В 12. При взаимодействии сильно щелочных детергентов с витамином В 12 образуется соединение кобаламиновой природы, снижающее рН до нейтрального, которое в дальнейшем не приводит к разрушению витамина В 12. Существующие способы выделения витамина В 12 проводятся в средах с слабокислым и нейтральным значением рН, что приводит к неполному извлечению витамина В 12 из клеток и низкому его выходу.Снижение рН раствора до 9,0 либо увеличение свыше 10,0 снижает выход витамина В 12 из клеток за счет физико-химических изменений, происходящих с молекулами детергента. Более низкий выход витамина В 12 наблюдается и при снижении концентрации ООСйа менее 0,5 оили увеличении ее свыше 3 за счет снижения числа мицелл детергента, способных специфически взаимодействовать с молекулами кобаламинов,Выбор рН и концентрации детергента подтверждаются данными, приведенными в табл, 1.Замораживание - процесс известный, но в предлагаемом способе он ускоряет разрушение клеток. В этих температурных границах (-4)+12) С происходит кристаллизация свободной воды в клетке. Ослабевают межмолекулярные связи в клеточной стенке, облегчается доступ ООСйа к внутреннему содержимому клетки, а именно к веществам кобэламиновой природы.Обработка 0,5-3%-ным раствором ООСМа, который взаимодействует с кобаламинами. ведет к образованию соединений, легко экстрагируемых органическими растворителями, Такое соединение с доугими детергентами неионной (тритон Х, 114, 305, твин 20, 40, 60, 65, 80), катионной (катамин АВ, цетилтриметиламмонийбромид, цетилтриметилпиридинийхлорид), анионный (холат и дезоксихолат натрия) природы, обладающих общеизвестным свойством - дезинтегрировать микроорганизмы, только ООСЙа оказался способным специфически извлекать витамин В 12 из бактериальных клеток (табл. 1),П р и м е р 1. Культуру пропионовокислых бактерий (штамм РгоропЬас 1 Егогп зпеггпапИ МУ) выращивают на синтетической среде. На 3-е сутки культивирования вносят 5,6-ди метил бе нзамидозол (5,5- ДМБ), На 5-е сутки культивирования клетки отделяют от культуральной жидкости центрифугированием при 5000 об/мин, затем промывают физраствором и зэмораживают5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 при -4 ОС в течение 1 ч, К 3 г замороженных клеток добавляют 8 мл 0,5%-ного раствора ООСйа при рН 10,0 и перемешивают на магнитной мешалке в течение 30 мин при комнатной температуре, после чего центрифугируют при 8000 об/мин 15 мин, Осадок промывают 2 мл 0,5 о -ного раствора ООСИа при рН 10,0, центрифугируют в том же режиме, а супернатанты сливают. В супернатант добавляют 2 мгКСй, встряхивают и выдерживают в темноте 20 мин. Витамин В 12 извлекают путем многократной экстракции небольшими порциями фенол-хлороформенной смеси (1:1). Из смеси витамин переводят в воду при добавлении 1,5 обьема хлороформа и 0,75 объема н-бутанола, Следы хлороформа и бутанола удаляют посредством обработки содержимого этиловым эфиром. Концентрацию витамина В 12 определяют спектрофотометрически при длине волны 361 нм.Параллельно проводят выделение витамина В 12 по известному способу с тем же количеством бактериальных клеток, Содержание витамина В 12 в экстрактах из клетокпропионовокислых бактерий: по известному способу - 480 + 0,2 мкг/г сухого весаклеток; предлагаемым способом760 +0,1 мкг/г сухого веса клеток. Выходвитамина В 12 при выделении предлагаемымспособом выше на 57-58 о ,П р и м е р 2, Выращивание пропионо.вокислых бактерий, отделение клеток,промывание физраствором и замораживаниеих проводят по примеру 1. К 3 г замороженных клеток добавляют 8 мл 3 -ного ООСКапри рН 9,0 с последующим перемешиванием на магнитной мешалке в течение 30 минпри комнатной температуре, затем центрифугируют при 8000 об/мин 15 мин. Осадок .промывают Зо -ным раствором ООСйа прирН 9,0. центрифугируют,добавляют 2 мго КСИ, встряхивают, выдерживают в темноте30 мин. Витамин В 12 извлекают путем многократной экстракции небольшими порциями фенол-хлороформенной смеси (1:1),затем операции проводят по примеру 1. Выход витамина 110 опо сравнению с известным способом.П р и м е р 3. Выращивание пропионовокислых бактерий, отделение клеток, промывание физраствором и замораживаниеих проводят по примеру 1, К 3 г замороженных клеток добавляют.8 мл 4-ного ООСйапри рН 11,0 с последующим перемешиванием на магнитной мешалке в течение 30 минпри комнатной температуре, затем центрифугируют при 8000 об/мин 15 мин. Осадокпромывают 4%-ным ООСйа при рН 11, цен 1717634трифугируют, добавляют 2 мг% КСИ, встряхивают в темноте 30 мин. Затем операции проводят по примеру 1, Выход витамина 812 составляет 37,5% по сравнению с известным способом.. П р и м е р 4. Выращивание пропионовокислых бактерий, отделение клеток, промывание физраствором и замораживание их проводят по примеру 1. К 3 г замороженных клеток добавляют 8 мл 0,3-ного ООСКа при рН 7,0 с последующим перемешиванием на магнитной мешалке в течение 30 мин при комнатной температуре, затем центрифугируют при 8000 об/мин 15 мин. Осадок промывают 0,3%-ным раствором ООСМа при рН 7,0, добавляют 2 мг% КСИ, встряхивают и выдерживают в темноте 30 мин, Затем операции проводят по примеру 1. Выход витамина 64,6% по сравнению с известным способом.П р и м е р 5, Выращивание пропионовокислых бактерий, отделение клето, промывание физраствором и замораживание проводят по примеру 1, К 3 г замороженных клеток добавляют 8 мл 0,50",.,-ного тритона Хпри рН 10,0 и пере лешивают на магнитной мешзлке в течение 30 мин при комнатной температуре, затем центрифугируют, добавляют 2 мг% КСК, встряхивают, выдерживают в темноте 30 мин, Затем операции проводят по примеру 1, Выход витамина 812 не наби юдают.П р и м е р б. Выращивантле пропионово к исл ы х бактерий, отделение клеток, промывание физраствором и замораживание проводят по примеру 1, К 3 г замороженных клеток добавляют 8 мл 0,5%-ного цетилтриметиламмонийбромида (ЦТАБ) при рН 10,0 и перемешивают на магнитной мешалке в течение 30 мин при комнатной температуре, затем центрифуги руют при 8000 об/мин 15 мин. Осадок промывают 0,5%-ным ЦТАБ при рН 10,0, центрифугируют, добавляют 2 мг/ КСК, встряхивают, выдерживают в комнате ЗО мин, Затем операции проводят по примеру 1, Выход витамина 812 не наблюдают.П р и м е р 7. Выращивание пропионовокислых бактерий, отделение клеток, промывание физраствором и замораживание проводят по примеру 1, К 3 г замороженных клеток добавляют 8 мл 0,5%-ного холата натрия при рН 20,0 и перемешивают на магнитной мешалке втечение 30 мин при комнатной температуре, затем центрифугируют при 8000 об/мин 15 мин, Оса-.док промывают 0,5 ф(,-ным холатом натрия при рН 10,0, центрифугируют, добавляют 2 мг% КСИ, встряхивают, выдерживают в темноте 30 мин, Затем операции проводят по примеру 1, Выход витамина В 12не наблюдают.Для сравнения данные, полученные под5 влиянием рН и концентрации ООСИа на выход витамина 812 из клетокРгоропЬассегогв 1 гецбепгесЫ зоЬз,з 1 егвап, сведены в табл. 1.Во всех приведенных примерах исполь 10 зуют известную синтетическую среду состава. г/л:(ч Н 4)2304 6К 2 Н Р 04 7КН 2 Р 04 315 йаС 0,5МЯЯ 04 7 Н 20 0,1Глюкоза 40Цитрат Ка 0,5Со С 2 2 Н 20 5 мг 20 -еСз 6 Н 20 1 мг%Растворы витаминов имикроэлементов По 1 мл/лДистиллированная вода До 1,0 л.Данные о специфической солюбилизи 25 рующей активности ООСИа характерны нетолько для мутантного штамма МУ, отличающегося высоким уровнем кобаламиногенеза, но и других штаммов (МУ-З,исходного природного штамма ПознанскоЗО го); табл,2,Конкретные значения концентрацииООСКв и величины рН обусловлены физикохимическим состоянием самого вещества,так как его солюбилизационные свойства35 обнаруживаются только при определенныхзначениях концентрации и рН.В табл. 3 приведена зависимость содержания витамина 812 от типа детергента (вседетергенты используются в концентрации40 0,5% при рН 10,0),Как видно из приведенных в табл, 3 данных, предлагаемый способ выделения витам ина812 существенно отличается отизвестных и обладает явными преимущест 45 вами; отсутствие процесса гидролиза сокращает время получения витамина. аотсутствие нагрева уменьшает затратыэнергии.50 Ф ар мула изобретения1, Способ выделения витамина В 12,включающий культивирование пропионовокислых бактерий, отделение культуральной 55 жидкости, обработку биомассы для разрушения клеток, экстракцию фенол-хлороформенной смесью и получение готового продукта, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью увеличения выхода витамина и упро1717634 10 Таблица 1 абл 10 щения способа, перед зкстрагированием клетки обрабатывают 0,5 - 3-ным раствором анионного детергента додецилсульфата натрия в щелочной среде при рН 9-10 в течение 30 мин, 5 2. Способ по и. 1, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что обработку биомассы осуществляют путем замораживания клеток при температуре (-4)+12) С и выдерживания в течение 1 ч с последующим оттаиванием,