Способ определения патулина в пищевых продуктах

,3 К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ледовательи .овощ ль ан тво СССР02, 1982. ТУЛИНА ном испарителе при температуре водяной бани не более 40 СДля очистки экстракта с помощью ( колоночной хроматографии на дно стеклянной колонки помещают кусочек ваты, на нее наливают суспензию 2 г силикагеля в 20 смЗ толуола. Толуолу дают стечь, не допуская просыхания колонки, добавляют еще 20 смз толуола и высыпают в колонку силикагель с адсорбированным экстрактом из круглодонной колби. Толуолу дают стечь и пропускают через колонку еще 100 см толуола. Толуольные элюаты отбрасывают. Круглодонную колбу опо" ласкивают 5 см ф смеси гексан - этилацетат (2:3) и выливают раствор в колонку, куда добавляют еще 100 см смеси Ьф3 гексан - этилацетат (2:3). Весь элюат собирают и унаривают в грушевидной колбе на ротационном испарителе при температуре водяной бани не более 40 фС до объема 0,2 см з. СУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМИ П 1 НТ СССР ИСАНИЕ ИЗ(71) Всесоюзный научно-иский институт консервнойсушильной промышленности(56) Авторское свидетельР 1103146, кл. С 01 М 33 4) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕШ 1 ЯПИЩЕВ 1 Х ПРОДУКТАХ Изобретение относится к пищевой промышленности и может быть использовано при анализе пищевых продуктов на содержание микотоксина патулина.Цель изобретения - сокращение способа и повышение его точности.Способ осуществляется следующим образом.В исследуемый образец, разбавленный водой, добавляют концентрированную соляную кислоту, растворы гексациано-(11)Феррата калия и уксусно- кислого цинка. Образец отАильтровывают от осадка через складчатый бумажный Аильтр. К Аильтрату добавляют гидрохлорид гидроксиламина, перемешивают и выдеряивают в течение 15 мин, Патулин из Аильтрата трижды экстрагируют этилацетатом, Экстракт сушат безводным сульФатом натрия, Фильтруют в отгонную колбу, куда добавляют силикагель, и упаривают досуха (до состояния, когда силикагель начинает свободно пересыпаться) на ротацион(57) Изобретение относится к пищевой 1промьппленности, а именно к областиопределения микотоксинов в пищевыхпродуктах. Целью изобретения является сокращение времени анализа и повышение его точности. Способ включаетподкисление соляной кислотой, осаждение веществ, мешающих экстракции,Фильтрацию патулина этилацетатом,очистку экстракта, двумерную тонкослойную хроматограАию, проявлениехроматограммы, обнаружение и количественное определение патулина. 1 табл.1585 У 54 те, Количество патулина в пятне анализируемой пробы определяют, сравнивая размер ъ интенсивность Алуоресценции пятна стандарта патулина и пятна патулина в анализируемой пробе. 11 ассовую долю патулина в анализируемой пробе вычисляют по формуле и Ч ЧэСщ.Чт Ч(нг/г или мкг/кг),Полученный раствор анализируют с помощью двумерной тонкослойной хроматограАии на пластинках "Силуфол". На пластинке на расстоянии 2,5 см от нижнего и правого краев карандашом проводят две тонкие линии. В точку их пересечения с помощью микро- шприца наносят аликвоту анализируемого раствора, На обеих стартовых 10 линиях отмечают по 3 точки, в которые микрошприцем наносят различные количества стандартного раствора патулина в интервале от 10 до 80 нг в пятне. После нанесения всех растворов пластинку одной из стартовых линий вниз помещают в камеру для тонкослойной хроматографии, предварительно заполненную смесью хлороАорм-ацетон (80:20) на высоту около 1 см. Проявление хроматограммы в первом направлении заканчивают тогда, когда фронт растворителя будет приблизительно в 1 см от края пластинки. После этого пластинку извлекают иэ камеры и сушат 25 до исчезновения запаха растворителя. Высушенную пластинку поворачивают на 90 и помещают второй стартовой линией вниз в другую хроматограАическую камеру, предварительно заполненную смесью толуол - этилацетат - муравьиная кислота (50:40:10). Проявление хроматограммы во втором направлении заканчивают тогда, когда фронт растворителя будет приблизительно в 1 см от края пластинки. После извлечения из камеры пластинку сушат до исчезновения запаха растворителя. Затем пластинку помещают в камеру с хлором. АтмосАеру хлора40 в камере создают, медленно приливая соляную кислоту к раствору марганцовокислого калия. Обнаружение пятен патулина достигается после опрыскивания пластинки раствором бензидина в муравьиной кислоте и просушивания ее в токе воздуха. Для увеличения устойчивости окраски пятен патулина пластинку покрывают тонким слоем параАина. Хроматограмму рассматривают в длинноволновом ультраАиолетовом свете. Патулин обнаруживается в виде зелено-желтых флуоресцирующих пятен на темно-фиолетовом Аоне. Обнаружение на пластинке пятна, соответствующего по цвету флуоресценции и хроматограАической подвижности пятнам стандарта патулина, свидетельствует о его наличии в анализируемом продукгде С - массовая доля патулина впродукте, мкг/кг;ш - масса навески продукта, г;и - количество патулина, обнаруженное в пятне, нг;Ч - общий объем, до которогодоведена навеска при прибав-лении к ней воды, смз,Ч - объем Аильтрата, взятый наанализ, смЧ - общий объем хлороАормногозэкстракта, мм3Ч - объем хлороАормного экстракта, наносимый на пластинку,ммПатулин устойчив в кислой среде ибыстро деградирует в щелочной, поэтому введение в образец соляной кислоты создает необходимые условия длястабилизации патулина. Кроме того,высокая кислотность среды существенно тормозит процесс дериватизации(оксимирования) патулина гидроксиламином,Использование гексациано-(1)Аеррата калия и уксуснокислого цинкавызывает быстрое и полное осаждениевзвешенных частиц, высокомолекулярных, белковых и полиАенольных соединений, создающих при смешивании водной фазы с этилацетатом трудноразделяемые эмульсии. Процессы осаждения и Аильтрации, занимающие 1-2 и10-15 мин соответственно, успешнозаменяет преследующий ту же цельпродолжительный (3-4 ч) диалиэ. Добавление в Аильтрат гидроксиламина и выдержка в течение 10- 20 мин ведут к получению производного оксиметилАурАурола, значительно отличающегося от патулина по хроматограАическим свойствам. Применение в первой системе растворителей д ля тонкослойной хроматограАии смеси хлороформ - ацетон позволяет полностью отделить патулин от производного оксиметилАурАурола.158 1Таким образом, сокращение времени проведения анализа достигается за счет замены диализа осаждением и фильтрацией, а повьппение точности, понимаемое как снижение случайной ошибки, вызываемой перекрыванием пятна патулина на хроматограмме пятном оксиметилфурфурола при сохранении патулина неоксимилированным эа счет подкисления образца соляной кислотой достигается использованием гидроксиламина в достаточной концент рации и необходимое время и обеспечением условий хроматографирования, обуславливающих эффективное отделение патулина от производного оксиметилфурфурола.П р и м е р 1. Анализ пюре из яблок.Навеску пюре массой 50 г помещают в стеклянный стакан, смешивают с небольшим количеством дистиллированной воды, а затем количественно переносят в мерную колбу вместимостью 250 смЗ. В мерную колбу вносят 2 смэ концентрированной соляной кислоты, 5 см раствора гексациано- (11)феррата калия с концентрацией 150 г/дм э и 5 см раствора уксуснокислого цинка с концентрацией 300 г/дм эСодержимое колбы доводят дистиллированной водой до метки, тщательно перемешивают и фильтруют в мерный цилиндр через плотный складчатый фильтр. Отфильтровывают 50 см раствора. В полученный Фильтрат вводят 1 г гидрохлорида гидроксиламина, содержимое цилиндра перемешивают и настаивают в течение 15 мин. Фильтрат из цилиндра переносят в делительную воронку. Этим же цилиндром отмеряют 50 смЗ этилацетата, переносят его в дели- тельную воронку и затем 1-2 мин интенсивно перемешивают содержимое. Смеси дают отстояться, и после полного разделения водный слой сливают обратно в цилиндр, а этилацетатный экстракт переносят в плоскодонную колбу с притертой пробкой. Экстрагирование в аналогичных условиях свежими порциями этилацетата проводят еще два раза.Этилацетатные экстракты объединяют и сушат в колбе с притертой пробкой безводным сернокислым натрием (приблизительно 10 г) в течение 10-15 мин. После просушивания объединенный экстракт Фильтруют через вату в отгонную колбу. Колбу с сер 5754 6нокислым натрием ополаскивают 15 см ээтилацетата, которые затем такжеотфильтровывают в отгонную колбу.В экстракт вводят 1 г силикагеляЭкстракт упаривают на ротационномиспарителе при температуре. водянойбани не более 40 С; Концом упариваниясчитают момент, когда силикагель начинает свободно пересыпаться. Рчяочистки экстракта с помощью колоночной хроматографии на дно стекляннойколонки помещают кусочек ваты, нанее наливают суспензию, содержащую2 г силикагеля в 20 смЗ толуола.Толуолу дают стечь, и, не допускаяпросыхания силикагеля, на него наливают еще 20 см толуола. На хромаэтографическую колонку, находящуюся 20 под слоем толуола, высыпают силикагель с адсорбированным экстрактомиз отгонной колбы. Через колонкупропускают еще 100 см толуола. Толуольные элюаты отбрасывают. Отгон ную колбу ополаскивают 5 см смесигексан - этилацетат в соотношении (2:3)и выливают раствор в колонку, кудаприливают еще 100 см э смеси гексанэтилацетат (2:3), Весь полученный 30 элюат собирают и упаривают в грушевидной отгонной колбе на ротационном испарителе при температуре водяной бани не более 40 ОС до объема200 мм . Полученный раствор анализизруют с помощью двумерной тонкослойной хроматографии на пластинках"Силуфол" размером 15 Х 15 мм.,На пластинке на расстоянии 2,5 см от нижнего.и правого краев карандашом прово О дят две тонкие линии. В точку их пересечения с помощью микрошприца наносят 20 мм анализируемого раствора.зНа обеих стартовых линиях отмечаютпо три точки, в которые микрошприцем 5 наносят различные количества стандартного раствора патулина в интервале от 10 до 80 нг в пятно. Посленанесения всех растворов пластинкуодной из стартовых линий вниз поме 5 г. щают в камеру для тонкослойной хроматографии, предварительно заполненную смесью хлороформ - ацетон (80::20) на высоту около 1 см. Проявлениехроматограммы в первом направлениизаканчивают тогда, когда Фронт растворителя будет приблизительно в1 см от,края пластинки. После этогопластинку извлекают иэ камеры и сушат до исчезновения запаха раствори7, 15857548 теля. Высушенную пластинку поворачи" вают на 90. и помещают второй стартовой линией вниз в другую хроматографическую камеру, предварительно заполненную смесью толуол - этилацетатмуравьиная кислота (50:40: 10). Проявление хроматограммы во втором направлении заканчивают тогда, когда фронт растворителя будет приблизительно в 1 см от края пластинки. После извлечения иэ камеры пластинку сушат до исчезновения запаха растворителя, Затем пластинку помещают в камеру с хлором. Атмосферу хлора в камере создают, медленно приливая концентрированную соляную кислоту к раствору марганцевокислого калин с концентрацией 50 г/дм . Обнаружениеэпятен патулина достигается после опрыскивания пластинки раствором бензидина в муравьиной кислоте и просушивания ее в токе воздуха. Для увеличения устойчивости окраски патулина пластинку погружают и вынимают иэ 25 расплавленного парафина с температу" рой около 60 фС. Парафину дают застыть, держа пластинку в вертикальном положении. Хроматограмму рассматривают в длинноволновом ультрафиолетовом 30 свете (365 нм). Патулин обнаруживается в виде зелено-желтых флуоресцирующих пятен на темно-фиолетовом фоне. Сравнивая интенсивность флуоресценции и размер пятен стандарта патулина в пятна патулина в анализируемом образце, определяют, что в пятне патулина в анализируемом образце содержится 50 мг вещества. Расчет концентрации патулина в пюре иэ яблок;40 С30 250 200-- 60 мкг/кг.25 50 205= 50 мкг/кг (нг/г). 45Таким образом, содержание патулина в анализируемом пюре иэ яблок составляет 50 мкг/кг.При пятикратной повторности среднее значение содержания патулина составило 50,2 мгк/кг, стандартное отклонение - 5,3 мкг/кг, относительное стандартное отклонение - 10,6%, доверительный интервал (Р=0,95) 6,57 мкг/кг.П р и м е р 2. Анализ повидла из яблок.Навеску повидла массой 25 г помещают в стеклянный стакан, смешивают.и Ч 1 Чз 50 250200щ Ч Ч 50 50 20 с небольшим количеством дистиллированной воды, а затем количественно)переносят в мерную колбу вместимостью 250 смЗ, Далее анализ проводят в соответствии с тем, как это описано в примере 1. После проявления хроматографической пластинки бензидином обнаруживают, что в пятне патулина в анализируемом образце содержится 30 нг вещества. Расчет концентрации патулина в повидле: П р и м е р 3, Анализ джема изслив,Навеску джема массой 25 г помещаютв стеклянный стакан, смешивают с водой, а затем количественно переносят в мерную колбу вместимостью250 см . Далее анализ проводят так,экак это описано в примере 1. Послепроявления хроматографической пластинки бенэидином обнаруживают, чтов пятне патулина в анализируемомобразце содержится 75 нг вещества.Расчет концентрации патулина в джеме: 75 250 20025 50 15200 мкг/кг.Анализ примеров позволяет заключить, что предлагаемый способ определения патулина, использующий осаждение и фильтрацию для отделения грубодисперсных частиц и высокомолекулярных соедйнений, оказывается пригодным для любых продуктов переработки плодов и овощей (соков, пюре, повидла, варенья, джема и порошков) независимо от их консистенции.П р и м е р 4. Анализ клубничного варенья, искусственно загрязненного патулином на уровне 40 мкг/кг, по предлагаемому способупри добавлении растворов гексациано-(ЕЕ)феррата калия и уксуснокислого цинка с концентрациями 150 и 300 г/дм соответственно в количестве 0,5; 3, 5; 7 и 10 смз5 проб образца варенья, искусственно загрязненного патулином на уровне 40 мкг/кг, разводят дитиллированной водой, переносят в мерные колбы, а затем вызывают осаждение взвешенных частиц и высокомолекулярных соединений добавлением растворов гексациано-(ЕЕ)феррата калия и уксуснокислого цинка в количестве по 0,5;3, 5; 7 и 10 см , В дальнейшем ана- зФлиз проводят согласно описанию впримере 1. Пробы, обработанные осадителями в количестве 0,5 и 3 ем,очень медленно Аильтруют, кроме того,первая из этих проб дает труднораз 5деляющуюся эмульсию с этилацетатом,Не обнаружено существенных различиймежду тремя остальными пробами вскорости Аильтрования и,скорости раз деления водного и этилацетатногослоев,Выбранное количество вводимых вобразец растворов гексациано-(11)феррата калия и уксуснокислогоцинкаявляется оптимальным. Добавлениемменьшего количества этих веществ может быть недостаточно для осаждениявсех высокомолекулярных соединений.Превышение этого уровня не сказывается на полноте или скорости осаждения.Поэтому использование больших количеств гексациано-(11)Аеррата калияи уксуснокислого цинка нецелесообразно. 25Введение в образец соляной кислотыимеет целью наиболее полное проведение дериватизации оксиметилАурАуролаи стабилизацию патулина на том жеуровне. 30П р и м е р 5. Анализ яблочногопорошка, искусственно загрязненногопатулином на уровне 200 мкг/кг, попредлагаемому способу при добавлениив анализируемую пробу 1 или 2 см3концентрированной соляной кислотыили без ее добавления.3 пробы по 25 г одного образцаяблочного порошка, содержащего патулин на уровне 200 мкг/кг, смешиваютс водой, переносят в мерную колбувместимостью 250 см и добавляют 1или 2 ем концентрированной солянойкислоты или не добавляют ее. Дальнейшее определение проводят, как в примере 1. Сравнение анализируемых пробпоказало, что при добавлении к пробе2 см концентрированной соляной кислоты оксимируется не более 2-37, патулина, при добавлении 1 см солянойкислоты - 5-бХ, а в отсутствии соля 50ной кислоты - около 10 Х патулина. Вто же время,при добавлении к пробе2 см концентрированной соляной кислоты неоксимированным остается около2 Х оксиметилАурАурола, при добавлении 1 см кислоты - менее 1 Е и в от-Ъсутствии соляной .кислоты оксиметилфурфурол оксимируется практически полностью. Таким образом, предлагае-. мое введение в образец 2 см концентз рированной соляной кислоты обеспечивает максимальную стабилизацию патулина в растворе, при этом остается очень небольшое крличество оксиметил-. фурфурола неоксимированным, что не мешает точному определению содержания патулина в пробе.Для оксимирования оксиметилАурАурола используется количество гидроксиламина, значительно превышающее ко-, личество оксиметилАурфурола в анализируемой пробе. В большинстве продуктов переработки плодов и овощей со.держание оксиметилфурфурола исчисляется десятками миллиграммов 1 кг продукта. Практически предельным можно считать концентрацию оксиметилфурфурола 100 мг/кг. С учетом этой концентрации в 50 смз сока мо жет содержаться 5 мг оксиметилАурфурола. Обработке гидроксиламином подвергается пятая часть берущейся на анализ пробы. Таким образом, в 50 см раствора, отбираемого для обработки гидроксиламином, содержится не более 1 мг оксиметилфурАурола. К 50 см добавляют 1 г гидрохлорида гидроксиламина, содержащего около 470 мг гидроксиламина. Высокая скорость и достаточная полнота реакции оксимирования достигается не менее чем 400-500-кратным превышением концентрации гидроксиламина над оксчметилАурАуролом.Д р и м е р б. Анализ виноградного сока, искусственно загрязненного патулином на уровне 20 мкг/кг, по предлагаемому способу при добавлении в анализируемую пробу гидрохлорида гидроксиламина в 400-500- кратном избытке по отношечню к оксиметилАурАуролу и настаивании в течение 3, 10, 15, 20 и 30 минд.5 проб по 50 см э одного образца виноградного сока, содержащего пату" лин на уровне 20 мкг/кг, разводят водой, переносят в мерные колбы на 250 смЗ, добавляют к ним по 2 смконцентрированной соляной кислоты и по 5 см растворов гексациано-(11)- феррата калия и уксуснокислого цинка, перемешивают и отфильтровывают. К каждому из полученных фильтратов, имеющих объем 50 см , добавляют по 1 г гидрохлорида гидроксиламина. Патулин экстрагируют из проб этил1585754 12 пластинке. ацетатом через 3, 10, 15, 20 и 30 мин. В дальнейшем анализ проводят согласно примеру 1.При анализе по предлагаемому спо 5 собу при четырехкратной повторности среднее значение содержания патулина составило 16,5 мкг/кг, стандартное отклонение - 5,5 мкг/кг, относительное стандартное отклонение - 33,3%, доверительный интервал (Р=0,95) 8,74 мкг/кг. При анализе по известному способу в 2 из 4 повторностей патулин обнаружен не был, в двух других содержание патулина составило 5 мкг/кг (предел обнаружения патулина).Влйяние продолжительности обработки Аильтрата гидроксиламином на степень дериватизации оксиметилАУР Фурола можетбыть оценено следующим образом: за 3 мин оксимируется около 50% оксиметилАурАурола, за 10 мин - 94-95%, эа 15 мин - 98%, за 20 и, 30 мин - 99%. Увеличение продолжи тельности обработки сверх 15 мин оценено как нецелесообразное из-за того, что остаточное содержание оксиметилАурАурола (менее 2%) уже не сказывается на результатах анализа. Кроме того, более продолжительная обработка сопровождается дальнейшим возрастанием доли оксимированного патулина.Оптимальной системой для отделе 35 ния патулина от оксиметилфурАуролаявляется смесь .толуол - этилацетатмуравьиная кислота (50:40:10). Поэто,му эта система была использована без изменения для надежного и эффективного отделения патулина на хроматограАической пластинке от остаточногоколичества оксиметилАурАурола. Другая система растворителей должна,отвечать следующим трем требованиям: максимальное отделение патулинаот производного оксиметилфурАурола,отделение патулина от других соединений, присутствующих в экстракте,и нахождение патулина в интервалеК между 0,35 и 0,65,П р и м е р 7. Анализ грушевогонектара, искусственно загрязненногопатулином на уровне 100 мкг/кг, по55новому способу с использованием вдвумерной тонкослойной хроматографиив первой системе смесей хлороАормацетон - муравьиная кислота в различных объемных соотношениях представлен в таблице.Данные о хроматограАической подвижности патулина и производного оксиметилАурАурола представлены в таблице. Установлено, что присутствие в смеси мураьиной кислоты снижает селективность системы, не гарантируя во всех случаях надежного отделения патулина от производного оксиметилфурфурола. Особенно хорошо это видно на примере системы 2. Система 4 обеспечивает наиболее приемлемое значение патулина, но очевидно, что селективность систем 5 и 6 лучше, В то же время при использовании систем 6 значение патулина оказывается вне зоны качественного проведения хроматографирования, что может сказываться на низкой эААективности отделения патулина от других веществ, присутствующих в экстракте. Таким образом, оптимальной для отделения патулина от производного оксиметилфурфурола и других веществ, присутствующих в экстракте, является система хлороформ - ацетон (80:20). Сравнение существующих способов определения патулина позволяет сделать заключение о том, что использование нового способа обеспечивает сокращение времени проведсния анализа с 7 до 4 ч за счет устранениядиализа и повышение точности результатов анализа эа счет снижения случайной ошибки, происходящей при перекрывании пятна патулина пятном оксиметилфурАурола на хроматограАической Формула и з б р е т е н и я Способ определения патулина в пищевых продуктах, включающий отбор пробы, добавление в нее кислоты, экстракцию этилацетатом, очистку экстракта адсорбцией на силикагеле, упаривание, элюирование толуолом и смесью гексан - этилацетат, двумерную тонкослойную хроматограАию с использованием в первой системе смеси хлороформ - ацетон, а во второй - смеси толуол - этилацетат - муравьиная кислота, проявление хлором, и раствором бензидина, Фиксацию3 4 1585754 Система раствори- Соотношение Патулинтелей компонентов Оксиметилфурфурол Система0,37 0,50 80:15:5 Хлороформ - ацетон - муравьиная кислотаТо же 0,67 0,42 0,50 0,43 0,27 0,65 0,28 0,34 0,10 0,02 70;23 й 7 80:18:2 70:30 80:20 90:10 23 4 5 6 Хлороформ - ацетон То же Составитель Л.Елисеева Редактор М.Циткина Техред Л.Олийнык Корректор М,СамборскаяЗаказ 2325 Тираж 509 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул Гагарина, 101хроматограммы парафином и обнаружение патулина в ультрафиолетовом свете с последующим его количественным определением, о т л и ч а ю щ и й -5 с я тем, что, с целью сокращения времени проведения анализа и повышения его точности, при введении кислоты используют концентрированную соляную кислоту с доведением рН пробы до 1,0-1,5, после чего дополнительно проводят осаждение мешающих веществ гексациано-(11)ферратом калияи уксуснокислым цинком с последующейфильтрацией осадка, добавляют к Лильтрату гидрохлорид гидроксиламинапри соотношении 1:50 и выдерживаютв течение 10-20 мнн, а в первой системе тонкослойной хроматографии соотношение компонентов в смеси хлороформ - ацетон устанавливают равным