Способ получения олигодезокситиотимидилатов

(Ы)М. Кд. С 07 Н 19/06 Ркударствеанй квпитет СССР ав авлан изфбретенвв и вткрмткй(71) Заявитель Институт цитологии и генетики САН СССР ленив(Б 4) СПОСОБ ПОЛ ОЛИГОДЕЗОКСИТИОТИИИДИЛАТОВ Изобретевованному окситиотимидилатов общей относится к усовершенособу получения олиго" НО О О- остаток тиминаводород ОстатОили -2-циднэт0;1;213 одезокситиотимидилатыогами природных полиделеотидов и способны усь их в ряде важных био де ля тиофосфата тиофосфата; сииоан ибон амен шн чес п О П И С А Н И Е 11910651ИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ4серы понижена настолько. что она не способна участвовать ни во енутримолекулярном взаимодействии с собственной 5-То 5-группой, ни .е межмолекулярных реакциях до снятия защиты.Недостатками этого способа являют" ся низкий выход олигонуклеотида, за.грязненность олигонуклеотида предыдущим олигомером и продуктами деградации исходного и образующегося компонентов; длительное время синтеза, а также проведение процессов выделения и очистки на каждой стадии синтези" рованного: олигомера.Скорость образования олиготимидилатов в случае применения триэтиламмонийных солей исходного тимидин- -3 -фосфотиоата и мономера низка даже при повышенной температуре.Целью изобретения является упрощение способа получения и повышения выхода олигодезокситиотимидилатое.Цель достигается тем, что олигодеэокситиотимидилаты формулыполучают путем взаимодействия литиевой соли тимидин-(или олиготимидилил)"1 1-3, -фосфотиоатов с 2 ,5 -дидезокси- -5 -йод-производными тимидина общей формулы 3 910651 ких систем, например в ферментативных реакциях, катализируемых РНК-зависимой ДНК-полимеразой (ревертазой), полинуклеотидкиназой и различными фосфодиэстеразами.Известны два способа получения олигодезокситиотимидилатов. Ключевой1 1 стадией в них является создание 3 ,5- -фосфотиодиэфирной связи между ос" татками тимидина, входящими в состав олигомера. Для этого используют моно- меры особого типа, содержащие в одной молекуле как электрофильную группу, способную эамещаться (тозилат), так и нуклеофильную (тиофосфат), ко" торая способна атаковать освобождаю" щееся место.Образование 3 ,5 -фосфотиодиэфирной связи происходит в результате реакции замещения тозилата в 9 -То 51 -тимидин-О-цианэтилфосфотиоатах 1 или в 5 -То 5-тимидин-5-2-цианэтилфосфотиоатах 21 тиофосфатом тимидина или олиготимидилата.Наиболее эффективным является спо соб 2. Пентатиотимидилат в,этом случае получают взаимодействием 1 эк" вивалента триэтиламмонийной соли тимидин-(или олиготимидилил)-3 -фос 1 фотиоата с 1-5 эквивалентами той же соли - 5 -То 5-тимидин-5-цианэтилфосфотиоата в диметилформамиде в присутствии трибутиламина.По окончании реакции проводят щелочной гидролиз цианэтильной защиты.3 Олигомер выделяют и очищают хромато- . графическими методами. Полученный продукт со свободной. 3 -фосфотиоатной группой вновь обрабатывают мономером. Таким образом, производят ступенчатое наращивание олигонуклеотидной цепи. Средний выход на стадию составляет 303.,время реакции 1-М суток при 30-37 С, общий выход пентатиотимидилата в расчете на исходный ти 43 мидин-фосфотиоат 0,7 Ъ Использование в этом способе мономеров с 5-цианэтилфосфотиоатными группами дает меньше побочных продуктов, чем в случае О-цианэтилфосфотиоатных про 50 изводных 1, так как нуклеофильность где ТЬ имеет приведенные выше зна"чения;К - водорЬд, остаток 1+-соли5-2-цианэтилфосфотиоата, в диметилформамиде при комнатной температуре с последующими обработкой полученного олиготимидилата щелочью и взаимодействием с новым мономером.Целевой продукт выделяют известными приемами, Продукт образуется практически с количественным выходом, поэтому его не следует подвергать хроматографической очистке и можно использовать на следующей стадии син- тезаимия 2 до ТИ- остатою гпРеакция тимидин-фосфотиоатовс 2,5 -дидезокси"5 -йодтимидин- -5-2-цианэтилфосфотиоатами протекаетв два раза быстрее,чем в известномспособе для соответствующих толуолсульфонильных производных. Это позволило сократить время реакции, и сни"вить температуру реаКционной смеси, З 5 до 18-25 ОС.Использование тимидин-фосфотиоатов в виде литиевых солей позволило уменьшить разложение реагентов и продуктов. Литиевые соли по срав О нению с аммонийными солями и солями щелочных металлов оказались наиболее реакционноспособными. Использование почти эквивалентных соотношейий ре-. - агентов. (3-5-ный избыток) при от:-45 сутствии побочных продуктов и практически количественноМ выходе олиго" нуклеотида существенно упрощает процесс его выделения. Ионообменную хро- МатОГрафиЮ ПрИМЕНяЮт ТОЛЬКО В КОНЦЕ 5 Всинтеза, а выделение на промежуточ"ных стадиях проводят простым,осаждением продукта ацетоном или при необ"ходимости гель-хроматографией на сефадексах.55Для гидролиза цианэтильной защитыцелесообразно использовать гидроокись лития, так как образующуюся литиевую соль олигонуклеотида можно сразу применять на следующей стадии.П р и и е р 1. 2-Дезокси-тими" дилил(3" 5)-5-дезокси-тиотими-дин 1-3-Ь-цианэтилфосфотиоат (1). Тимидин-фосфотиоат(дилитиеваясоль, дигидрат, 0,0386 г, 0,1 ммоль) и 2 ,5 -дидезокси-тиотимидин- с 1-5-цианэтилфосфотиоат (литиевая соль, 0,053 г, 0,105 ммоль) смешивают в 1 мл диметилформамида, смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч. Конец реакции определяют методом йодометрического титрованйя тиофосфатных групп и хроматографией на диэтиламиноэтилцеллюлозе в градиенте Май после щелочного. гидролиза цианэтильной защиты. По окончании реакции к реакционной смеси добавляют ацетон (5 мл), выпавший осадок центрифугируют,. промывают ацетоном (3 х ф 1 мл), сушат в вакууме. Выход соединения 1 в виде дилитиевой соли 0,0685 г (953). Результаты анализа образца после очистки гель-хроматографией на сефадексе 0-25 в 0,02 И МН 4 НСО приведены в таблице.П р и м е р 2. 2 -Дезокси тимидилил-(35 )-дезокси-тиотимидин -З.-фосфотиоат (2)..Соединение 1 из примера 1(0,0685 г,0;095 ммоль) растворяют в 1 мл 0,5 н.гидроокиси лития, выдерживают 1 ч,нейтрализуют избыток щелочи катионообменной смолой Дауэксв Н -формедо рН 7, смолу отфильтровывает,фильтрат лиофильно высушивают. Выходсоединения 2 в виде трилитиевой соли0,063 г (983)П р и м е р 3. 2 -дезокси -этимидилил-(3 + 5 )-5 -дезокси"5 -тиотимидилил 5 )5 "дезокси-тиотимидин 1-3 -фосфотиоат (3)Трилитиевую соль соединения 20,063 г, 0,095 ммоль) из примера 2 1 фрастворяют при встряхивании в 1 млдиметилформамида, прибавляют раствор литиевой соли 2,5 "дидезоксич-5 -иодтимидин-3-2-цианэтилфосфотиоата (0,050 г, 0099 ммоль) в ф1 л диметилформамида и выдерживают1 ч. Продукт выделяют, как в примере 1, используя вдвое большее количество ацетона, Защиту с тиофосфатной группы снимают так же, как в при 2мере 2. Выход тетралитиевой соли соединения 3 0,089 г (953). Результатыанализа приведены в таблице.П р и м е р 4. 2 "Дезокси тимидилил-(3 " 5 )-ди-(5 -дезокси"5 -тио- Зотимидилил)-(3- 5 )-5 -дезокси-тиотимидин 3-3-фосфотиоат (4).Тетралитиевую соль соединения 3иэ примера 3 (0,089 г, 0,089 ммоль)растворяют в 2 мл диметилформамида Зпри встряхивании. Прибавляют литиевую соль 2,5-дидезокси-йодтимидин-5-2-цианэтилфосфотиоата(0,0475 г 0,0935 ммоль) и встряхивают 3 ч. Продукт выделяют как в при-фмере 3. Выход пенталитиевой соли соединения 4 0,110 г (934). Результатыанализа приведены в таблице,П р и м е р 5, 2 -Дезокси- тимидилил-(3. 5 )-три-(5 -дезокси-тиотимидилил)-(35)-5-дезокси-тиотимидин 3-3 -фосфотиат (5).Это соединение получают, как соединение 4 в примере 4 используя 560,055 г (0042 ммоль) пенталитиевойсоли соединения 4 и (0,022 г,0,044 ммоль) литиевой соли 2 ,5--дидеэокси-йодтимидин-"2"цианэтилфосфотиата. Выход гексалити- ззевой соли соединения 5 0,064 г (931).Результаты анализа приведены в таблице,П р и м е р 6. 2 -Деэокси- тимидилил,(3 - 5 ) -три- ,5 -деэокси-(пример 4, 0,055 г, 0,042 ммоль) и2,5 -дидезокси-йодтимидин (0,03 г,0,084 ммоль) растворяют при встряхивании в 1,5 мл диметилформамида. Затем раствор выдерживают еще 6 ч,осаждают олигонуклеотид 6 мл ацетона, осадок центрифугируют, промываютацетоном (3 х 5 мл), высушивают в вакууме, растворяют в 1 мл 0,02 н.МННСО и наносят на колонку с сефадексом 6-25 (550 см). Элюцию про"водят 0,02 н. ЙННСО в 204-ном этаноле, рН 7,5. После удаления МННСОи воды в вакууме продукт лиофильновысушивают. Выход соединения 6 в видететрааммонийной соли 0,063 г (943),Результаты анализа приведены в таблице,Для ферментативного расщепления0,1 ммоль соединения 6 инкубируютс сырым змеиным ядом (0,05 мг) в0,05 М трис-НСЯ буфере и 0,01 М МдСЮ 1 при 37 С в течение 10 мин. Раствор концентрируют в вакууме, продукты гидролиза выделяют хроматографией на бумаге в системе изопропанол-вода (6:4),элюируя их водой и определяя концентрацию спектрофотометрически.фПри гидролизе образуются 2 ,5 -дидезокси-тиотимидин-фосфат и 2 -дезокситимидин, которые были идентифицированы по Уф-спектрам и сравнением с контрольными образцами соответствующих кислородных соединений.Правильность структуры полученных олигодезокситиотимидилатов (1"6) ос" новывается:на количественном протекании реакции образования 3 5-фосотиодиэфирной связи без каких-либо побочных продуктов;на наблюдении увеличения молекулярного веса и отрицательного заряда, что следует иэ результатов гель-хроматографии и ионообменной хроматографии;на образовании при неполном фосфодиэстераэном гидролизе набора олигонуклеотидов, число которых соответствует числу мономеров исходного олигонуклеотида, что свидетельствует о природном (35)типе связи между ними;9 910651на полном расщеплении окислителямифосфотиодиэфирных связей в исходном чолигонуклеотиде с образованием набо- сра окисленных мономеров; л Уф-спектрмакс нм р с макс)НОа Градиентнаяэлюция"моль Соединение 267(9600) 0,63 267 (19200) Оэ"6 267 (19200) 0,46 266 (28800) 032 266 (38400) 0,23 266 (48000) 0,15 266 (48000) 0,16 0,060 О, 062 О, 090 0,120 0,130 О, 138 0,125те сократить затраты времени на одну стадию до 3-4 ч, довести средний вы" ход на стадию до 953, снизить темпе" ратуру и эа счет применения йочти эквивалентных соотношений реагентов и отсутствия побочных продуктов существенно упростить процедуру выделения и очистки продукта,Формула изобретения Способ получения олигодеэокситиотимидилатов общей формулы носн и-сн, т ОГф3 - " - Сн ТЬ20 мерами, со .цепторнуюфотиоатную де и обраб дилата щел действием ата илфата; имидин и моноТимидин-фосфотиоат.(5) 2 д(Трэ Трэ Трэ Трэ Трэ)(6) 2 с(Трэ Тря Трэ ТрэТ) фГель-хроматография на сефадексе Св 0,02 М бикарбонате аммония в 20-ном этаноле, колонка 5 х 50 см; расчет вели по формуле Кд = Чео/М, где Чэ. - объем выхода вещества с колонки; Чо " свободный объем; Ч 1 = 2,5 г/смЧ колонки.фф Ионообменная хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе, колонка О, 5 х 60 см, градиент 0-0,3 М МаСР в 7 М мочевине, рН 7,5.Предлагаемый способ получения олигодеэокситиотимидилатов позволяетзю где Тп - остаток тимина;В - Н, остаток тиофос5-2-цианэтилтиофои 01 1 1 21 3включающий взаимодействие-фосфотиоата с нуклеотидны 10на соответствии Уф-спектров полуенного олигонуклеотида Уф-спектрам оответствующих кислородных олигонукеотидов. ержащими 5 -электроноакруппуи 3-5-2-алкилфосгруппу, в диметилформамитку полученного олиготимичью с последующим взаимо- новым мономером, о тСоставитель Г. КонноваРедактор 3. Бородкина ТехредС.Мигунова Корректор М. Демчикеае в гЗаказ 1021/26 Тираж 390 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб.,д. 4/5% л и ч а ю щ и й с я тем, что, с где ТЬ имеет приведенное значение; целью упрощения процесса и повыаения К - Н, остаток 1. -соли 3-2- выхода целевого продукта, литиевую -цианэтилфосфотиоатасоль. тимидин-(или олиготимидилил)-3-Источники информации, -фосфотиоатов подвергают вэаимодейст" принятые во внимание при экспертизе вию с 21,5 г-дидезокси"5 -йодпроизвод. 5 йап 1 з 1 ач СЬ 1 аде 1 апд дозерп ными тимидина общей формулы йаяучагу, йцс 1 еорЬ 11 с нкеасс 1 опз о 1 ЮСН 2 О бове йцс 1 еозде Рпозрпоготп 1 оа ез" , Ап. Окреп. ос 94,. 2079, 1972. 2,4 . Кгезве., К. Мадра 1 апд Ма 9 учагу йцс 1 еос Асй. Кез. 2, ОВ 1"9 197 (прототип).