Способ получения алкалоидов спорыньи

ОПИСАНИЕ ЙЗОБРЕТЕНИЯ735154 Сюз Советекик Сециапиетичжиих Республик(3) 16096/77 . (8 д) Великобритания Государствеииый комитет СССР ио делам изобретеиий и открытий(088, 8) Опубликовано 150580. Бюллетень ЭЙ 18 Дата опублиКования описания 20.04,80 ИностранцыЭнцо Бикко, Мария Луиза Бьянчи,и Челестино Спалла(72) Авторы изобретения Анаклето Мингетти Иностранная фирма фСочиета Фармасьютичи Италиа С.п.арф(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АЛКАЛОИИДОВ СПОРЬИЬИ лы 1 В 1МН --0 0- снз иэопропил где метил, этил,сн проявляют см, дакескиедикалов алкалоиг ) - бн,-и-бн0 1 1Изобретение относится, к химико-фармацевтической проьыапенности, к получению алкалоидов спорыньи,Предложенныеалкалоиды новые и способ их получения в патентной и на учно-технической литературе .не описан.Целью изобретенйяявляется получение алкалоидов спорыньи общей форму 2,незамещенная линейная Сз-С-алкильнаягруппа, галогенэамещенная линейнаяСз-С-алкильная группа, галогензамещенная бутильная группа,Вв - С-С-алкил, Сс-С-алкокси, галоген и 9,10-дигидропроиэводных.Эта цель достигается. тем, чтоштамм Се,ач 1 серз рцгрцгеа АТСС 15383,Сйач 1 серз рцгригеа АТСС 20103 илиССач 1 серз рцгрцгеа АТСС 20019, зависимые от негидроксилированных аминокислот, выращивают на питательной среде,содержащей в качестве предшественника негидроксилированную аминокислотус последующим выделением целевого продукта.Кроме того, в качестве негидроксилнрованной аминокислоты используютлейцин, фенилаланин; фенилаланин, замещенный галогеном, алкнлом, радикалом алкокси, тиенилом; б -пираэолил",фурил-, пиридилаланинт линейные СС амийокислоты или галогенэамещенные натуральные аминокислоты,Новые алкалоиды спорыньи фармакологические свойства ные в табл. 1) . Фармакологи свойства зависят от типа ра В и Ва, и активность этих735154 Таблица 1 Соединение Рп Эс 0,07 7 тамии 5 -Дизилэ бенензил- отамин 00 18 0,10,08 0 0,0 150 0 гидроэрг 4 О истин 3О,О 190 торой они были му или ее аналогов. Становится во чительно более в ида, содержащего в результате доб личеств аминокис му, на первой ст зываемой .трофофа О го добавления зн аналога на второ называемой идиоф Алкалоиды спо дующим образом.генно зависимыми,случают слеы дов может изменяться в зависимостиот того, присутствует ли двойная связьв положении 9-10 или ее удаляют гидрированием,Так, например, новые алкалоиды спорыньи общей формулы 1, в которой В - :СЯ, а В - незамещенный бензил, обладают сосудосуживающей активностью Ди гидроэ ргот амин5-Ди бен зил -и-хлор-бензилдигидроэрготамин 5 -Дибензил-и-хлорбезилдигидроэргокристинВсе три новых производных проявляют по сравнению с родственными соединениями повышенную -адренолитическуюактивность, как приприменении 1 пЧ 11 го, так и ж ч 1 уо. С другой стороны, в некоторой степени понижаетсяострая токсичность, Предлагаемые алкалоиды спорыньи представляют собойамиды лизергиновой кислоты, содержащие циклонпептидный фрагмент, получаемый биосинтетически в результатеконденсации З-аминокислот, одна изкоторых, т. е, пролин, присутствуетво всех веществах. Циклольный фрагмент состоит, соответственно, в случае эрготамина (В =СНз, В =СНС 6 Н 5)из одной молекулы фенилаланина и одной молекулы о -гидроксиаланина; в.,случае эргокристина (В = СН(СН);В =СНСь)1) из одной молекулы фенилаланина и одной молекулы А -гидрокси-валинау в случае зргокриптина (В; -СН(СН); В=СНСН(СН - из молекулы лейцина и одной молекулы к -гидроксивалина.Штаммы С, ригрцгеа,предварительнд .обработанные мутагенным агентом и потерявшие спосо бность к росту в отсутствии негидроксилированныхаминокислот (т. е. фенилаланин или лейцин),приобретают Способность образовыватьалкалоиды, которые содержат в качестве конечной аминокислоты аналог, присутствующий в среде, при росте в присутствии аминокислоты, к действию кои поэтому их можно использовать примигрени, Производныв, в которых Визопропил, а В - замещенный бензилили алифатическая цепочка, имеющаягидрированную двойную связь в,положении 9-10, обладают адренолитйческойактивностью и воздействуют на центральную нервную систему, их можноиспольэовать для лечения гипертонии. Адренергическая блокада можным получить знасокие выходы алкало- аналог аминоки лоты вления небольших кооты, требуемой штамдии ферментации, назой,. и последующечительных количеств стадии ферментации, зой,5Мицелиальную пленку скоса со штаммов продуцентов эрготамина или эрго- кристина или эргокриптина суспендируют в стерильной воде и раздрабливают путем встряхивания в смесителе, после чего фильтруют через шелковую ткань, Фильтрат, содержащий в основном одноклеточные фрагменты, облучают уф-светом, чтобы добиться 90-99% смертности, Суспензию разбавляют стерильной водой и помещают в чашку Петри на твердую среду, в которую допол- нительно добавляют аминокислоту, для которой отыскивают требуемые мутанты (т, е. лейцин или фенилаланин)ПосО ле инкубирования в течение необходимого времени разросшиеся колонии переносят по хорошо известной методике в среду,. не содержащую аМинокислоты, для которой отыскивают требуемые мутанты.Штаммы, способные расти в первой среде и не способные расти во второй среде, являются зависимыми от аминокислоты. Их сохраняют последовательными переносами в сред 7, сбдержащую аминокислоту.Для получения алкалоидов требуемые5 мутанты выращивают в жидкой среде, содержащей источник углерода, источник азота, источник фосфора, источник серы и несколько минеральных солей, а также аминокислоту, которая требуется штамму. Количество аминокислоты может изменяться в пределах 0,5-2 г/л. После инкубирования в течение 3-5 дней в культуры добавляют аминокйслоту, требуемую штамму, в количестве 3 - 6 г/л и затем инкубируют еще в течение 9-11 дней так, чтобы общее время инкубации было 14 дней. Культивирование (ферментацию) можно проводить во встряхиваемых колбах либо в фермен О торах различных размеров.К концу ферментации бульоны культур содержат аналог алкалоида и небольшие количества обычного алкалоида. Аналог алкалоида экстрагируют следующим об- р 5 разом. Бульон фильтруют и мицелий несколько раз экстрагируют 4-ным водным раствором винной кислоты. После фильтра- ЗОции водную фазу подщелачивают до рН .9 гидроокисью натрия и экстрагируютхлористым метиленом,Органическую фазу концентрируют,осаждают и перекристаллизовывают ввиде соли фосфорной кислоты. Из фосфора получают свободное основание иегО дополнительно обогацают природными алкалоидами путем хроматографирования на колонке с силикагелем.Затем проводят отделение новых продуктов от природных продуктов путемфракционной кристаллизации.Концентрацию алкалоида определяютспектрофотометрически после подкрашивания реагентом Ван Урка, причемрасчет ведут при 550 нм.Соотношение между природными и замещенными аминокислотами, присутствующими в пептидном фрагменте, определяют с помощью кислотного гидролиза алкалоида и количественным определениеммоноаминокислот,Для. идентификации конечных продуктов применяют обычные методы физикохимического анализа (ЯМР, ИК- и Уфспектроскопия, масс-спектроМетрия ит. п.),Фенилаланинпотребляющие мутантыштаммов-продуцентов зргокристина илизрготамина могут производить алкалоиды, которые внедряются в фенилаланиновый фрагмент молекулы фенилаланина,замещенной в бензольном кольце галогена, алкилами или алкоксилами. Онитакже могут производить алкалоиды,внедряясь в фенилаланиновый фрагмент Я его изоэфиров, таких как тиенилаланин, А - и-пиразолилаланин, фурилаланин, пиридилаланин.Лейцинпотребляющие мутанты щтаммов-продуцентов эргокриптина могут . вырабатывать алкалоиды, которые внедряются в лейциновый фрагмент молекулы линейной А-аминокислоты, имеющей 2-7 атомов С. Они также могут производить алкалоиды, внедряясь "в фрагменты лейцина природных аминокислот, замещенных атомами галогена, например таких как 5,5,5-трифторлейцин.П р и м е р 1. 5-Дибензил 5- -Я-хлорбензилэргокристин,Мицелиальную пленку 12-дневного скоса на твердой среде Ьер 3 (см. прилагаемую табл. 2) штамма АТСС 20103 С, рпгригеа продуцента эргокристина в погруженной культуре переносят в 50 мл дистиллированной стерильной воды и фрагментируют в смесителе Варинга в течение 20 с. Суспензию фильтруют через шелковую ткань и 5 мл фильтрата выдерживают на свету (520 мкВт/см ) Уф-лампы в течение 45 с. Обработанную суспензию после разбавления помещают на твердую среду ТМ (см, табл. 2), в которую дополнительно добавляют 1% фенилаланина, в чашки Петри. Чашки инкубируют при 28 С 10-12 дней. Раз -. росшиеся колонии переносят хорошо известным способом посева на чашки методом отпечатков на твердую среду ТМ в чашки Петри, и эти чашки инкубируют при 28 С в течение 10-12 дней.В ходе сортировки 3000 колоний было обнаружено, что четыре штамма не способны расти на минимальнбм количестве среды ТМ. Эти штаммы подтверждают выделением в среде ТМ, а также в среде ТМ, в которую добавляют фенилаланин и два из них представляют собой мутанты, зависимые от фенилаланина. Десять колб на 300 мл, каждая из которых содержит 50 мл среды ТС (см. табл. 2), в которую добавляют 1 г/л фенилаланина, стерилизуют при 100 С в течение 30 мин и каждую из колб инокулируютмицелиальной пленкой, соответствующей прйблизительно 1 см среза твердой среды рер 3 штамма мутанта. Эти колбы инкубируют при 23 С 4 дня во врац 1 ающейся качалке, при скорости вращения 225 об/мин, Эти колбы соответствуют фазе вегетации.Пятьдесят колб на 300 мл, каждая из которых содержит 40 мл среды Т 25 (см, табл. 2), в которую добавляют 1 г/л 1-фенилаланина, стерилизуют при 105 СС 25 мин, инокулируют 5 мл вегетативной культуры и инкубируют прио23 С в той же качалке, что использовали для фазы вегетации. Через 4дня в колбы добавляют 4 г/л П -хлорфенилаланина.Через 10 дней йнкубирования культуры группируют, в результате чегополучают около 2 л бульона, который содержит 700 мкг/мг"-пептидных алкалоидов, Их экстрагируют следующим об-.разом., 5Бульон культуры фильтруют, фильтрат отбрасывают, а мицелий суспендируют в 5-ном водном растворе винной . кислоты. После тщательного встряхивания и фильтрации осадок экстрагируютеще два раза. Объединенные фильтратыподщелачивают до рН 9 с помощью 20-,-ного раствора ИаОН и экСтрагйруютнесколько раз хлористым метиленом,Органйческую фазу промывают водой,концентрируют и осаждают гексаном. Полученное такйм образом необработанное основание (0,9 г) обесцвечиваютактивированным углем, растворяют в10 мл 95-ного этанола и добавляют.0,8 мл 75-ного раствора НРО. Полученнйй раствор нагревают с обратным холодильником в темноте 30 мин и выдерживают при 3 С 5 дней.В результате кристаллизуется Фосфат (0,5 г), который содержит смесь р 5эргокристина (20) и 5-дибензил.-5- -П-хлорбензилэргокристина (80) ИэФосфата подцелачиванием получают необработанное -основание, экстрагйруютСНС 1 и перекристаллизовыва 1 от"иэацетона, Закристаллйэованный продукт "хроматографируют на колонке с сили- кагелем, используя в качестве элюанта смесьСНСРЗ и мЕтанола (исходноесоотношение 99 : 1, конечное соотношение 90 : 10)После отбрасывания .фракций содержащих декстрозовращающие изомеры, выделяют Фракцию, обогащенную 5-дибензил-Л-хлорбензилэргокристином. Последовательной перекристаллизацией"из бензола, метанола 40ацетона выделяют искбмый продукт(100.г), Кйслотный гидролиз пептидного фрагмента дает аминокислоты про.лин и п -хлорфенилаланин в соотношении 1 : 1. В результате щелочного . 45гидролиза получаютлизергиновую кислоту и 3,3-диметилпировинограднуюкислоту. П р и м е р 2. штамм мутанта,- :полученный в результате обработки Уф- ,светом, согласно примеру 1 использу- . ют для Инокуляции 8 колб среды ТС притех же условиях, что описаны"в примере 1. К концу фазы вегетации содержимое колб обЪединяют, в резуль-. тате чего получают 400 мл культурального бульона и его используют для ийокулирования 10-литрового. Ферментера, - содержащего б л среды Т 25., в которую добавляют 1 фенилаланина.Щ Ферментер снабжают мешалкой диско- турбинного типа, работающей при аэрации,"соответствующей 0,5 л/мин и ско- рости вращения 600 об/мин. ТеМПература инкубации, 23 С. Через четыре дняпосле начала Ферментации в культуру добавляют 4 Ф-хлорфенилаланина, На 13-й день ферментации с бульона культуры снимают урожай.Общее содержание пептидных алкалоидов соответствует 600 мкг/мл, 65из которых представляет собой 5-дибензил-П-хлорбензилэргокристин.Экстракцию проводят по методике,:опи.санной в примере 1.П р и м е р 3. Тот же штамм, чтов примере 1, ферментируют в колбахпри тех же условиях, что в примере 1,как на стадии вегетации, так и настадии продуцирования, единственноеотличие заключается в том, что на4-й день ферментации добавляют П-фтор-.фенилаланин. На 14-й день ферментацииэкстракцией бульона получают750 мкг/мг пептидных алкалоидов, причем 80 из этого количества составляет 5-дибензил-О-фторбензилэргокристин.П р и м е р 4. Штамм ОТСС 15383,продуцент эрготамина, обрабатываютУФ-светом в условиях, описанных впримере 1. В результате обработкиполучают два фенилаланийзависимдхмутанта на 2000 подсчитанных колоний.Одйн иэ этих штаммов используют вкачестве прививочного материала, который добавляют в колбу ферментациипри тех жь"условиях, что описаны впрймере 1, как во время вегетативной,.так и во времй продуцентной фаз, На4-й день продуктивной фазы добавляют4 п -хлорфенилаланина. На 14-й деньиз бульона получают. 900 мкг/мл пеп-тидных алкалоидов, причем ЬО изэтого количества составляет 5-дибензил-О-.фторбензилэрготамнн.П р и м е р 5. Штамм ОТСС 20019,продуцент эргокриптина, обрабатываютУф-светом, как описано в примере 1.В результате обработки получают три .лейцинзависиьвх мутанта из 4000 подсчитаннйх колоний,Один из этих штаммов ферментируютпри условиях.ив среде, описанной впримере 1, причем единственное отличие заключается в том, что на фазахвегетации и продуцирования добавляют1 г/л и 2 г/л Ь-лейцина, соответственно, На 4-й день Фазы прбдуцирования добавляют б г/л Ь-норвалина, К14-му дню бульоны содержат 1000 мкг/млпептидных алкалоидов, причем 80 иээтого количества составляет 5-диизо-,бутил-н=пропилэргокриптин.П р и м е р б. Лейцинзависимый:штамм, используемый в примере 5, Ферментируют в колбах при тех же услови;ях, как на фазе вегетации, так и нафазе продуцирования, затем добавляют3 г/л 5,5,5-трифторлейцина, на 4-йдень фазы продуцирования Йа 14-йдень ферментации бульоны объединяюти экстрагируют согласно общей методи20 18 до рН 5,2 до рН5,2 до рН 5,2 Водопроводная вода,мл До 1000 До 1000 Дистиллированнаявода, мл До 1000 До 1000110 оС х 110 оС х 110 ОС х 105"С хх 20 мин х 20 мин х 30 мин х 5 мин Стерилизация КН - 0 предами-м где В- метил л, изопропи- СН7 2. чаю ве н испо пособ по п, 1, и й с я тем, ч роксилированной уют лейцин, фени б ичест- слоты Н овка аминоки алании;- СНг СН ЖЭ,ег ль ке, описанной ранее. Общий выход пептидных алкалоидов составляет600 мкг/мл при б 0-ном внедрейиитрифторлейцина,Формула изобретения 1. Способ получения алкалоидовспорыньи общей Формулы Предлагаемый способ позволяет получить новые алкалоиды спорыньи, обладающие Фармакологической активностью. незамещенная линейная С-С-алкильная группа, галогенэамещенная линейная С-С-алкильная группа, галоген 45 замещенная бутильная группа,ВС С 4 алкил С С 4 алкокси галоген,и 9,10-дигидропроиэводных, о т л ич а ю щ и й с я тем, что штамм50 СГач 1 серв рцгрцгеа АТСС 15383,Сач 1 серв рцгрцгеа АТСС 20103 нлиСач 1 серэ рцгрцгеа АТСС 20019,зависимые от негидроксилированныхаминокислот, выращивают на питатель 55 ной среде, содержащей в качествешественника негидроксилированнуюнокислоту с последующим, выделениецелевого продукта.735154 12 нюхании, замещенный галогеном, алкилом, радикалом алкокси," тиенилом; -пираэолил-, файл-, пйридилаланин; Составитель С. МалютинаТехред А.щепанская Корректор М. Пожо Тираж 673 ,. Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Филиал ППП Патент), г. Ужгород, ул. Проектная, 4Редактор Е. КоринаМВФЙМФКФЖВВЪЬФФу - аФЗаказ 2 10 8/5 7 линейные С-С -А-аминокислоты или галогензамещенные натуральные аминокислоты,