Способ выявления поверхностного антигена гепатита в

(щ 7351 53 Союз Советскна Социалистических Респубпнк(51) М. Кл. А 61 В 10/00 Госуаарствеииый комитет СССР но елам изобретении и открытий(088,8) Опубликовано 150580. Бюллетень18 Дата опубликования описания 20.05,80 ИностранцыЛлойд Алан Шик и Стефен Кеннет Карпентр(72) Авторы изобретения Иностранная фирма Майлз Лабораториз, Инк( 54) СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ПОВЕРХНОСТНОГО АНТИГЕНАГЕПАТИТА В Изобретение относится кобластимедицины, а именно к диагностике заболеваний гепатитом В,Известен способ выявления повер: -ностного антигена гепатита В в исследуемой пробе сыворотки или плазмы путем определения разности радиоактивности сыворотки, содержащей специфические меченые антитела, до и после.ее контакта с фиксированным на инертном носителе антигеном гепатита В 1),Однако известный способ недостаточно чувствителен.Целью изобретения является повышение чувствительности способа, 15Эта цель достигается тем, что исследуемую пробу пропускают через ко-лонку, заполненную анионообменным материалом в форме частиц, которые находятся в равновесном состоянии в жид-кости при рН 5-8, промывают колонкупри рН 5-8, затем пропускают меченныерадиоактивным иэотопом специфическиеантитела с заранее определенным уровнем радиоактивнбсти, инкубируют в течение 0,5-18 ч при 4-50 оС, затем ко-лонку промывают при рН 5-8 и определяют радиоактивность анионообменногоматериала или элюата из предыдущейстадии.30 2Предлагаемый способ используют для выявления поверхностного антигена гепатита В (НВ 5) в жидких пробах, таких как пробы сыворотки или плазмы. В качестве адсорбентов для антигена гепатита используют различные гидрофобные матдриалй, включая некоторые алкилзамещенные полимеры, такие как со -аминоалкилэамещейные агары, однако предпочтительно использовать ионообменные материалы. Значение рН для антигена НВ. находится в диапазоне 3,5-5, а для анти-НВ 8, предпочтительно рН равно 6-8.В качестве адсорбента используют анионообменные вещества - диэтиламиноэтилзамещенные полимеры, в частности те, в которых содержатся полисахариды, например целлюлоза или декстран, в качестве основной цепи, В качестве адсорбента для антигена НВ можно испольэовать ДЕАЕ-целлюлозу.В качестве адсорбента можно испольэовать катионообменный материал, такой как карбоксиметилцеллюлоэу, если значение рй меченого анти-НВ измене 3но до значения, которое ниже аналогичного показателя для антигена НВ .Для выявления антигена НВ 5 в сыворотке или плазме пробу вводят в колон. 1458 + (4 х х 54) = 1678 Граничное значение 65 ку, содержащую анионообменное вещество в виде частиц, которые находятсяв равновесном состоянии в буфернойжидкости с РН 5-8, предпочтительно6,5- 7,5, Затем через колонку пропускают буферную жидкость с рН 5-8, предпочтительно 6,5-7,5, чтобы удалитьполностью антиген НВ , который не адсорбировался анионообменным вецест -вом.После этого вводят в анионообменный материал заранее определенныйобъем раствора, меченного радиоизотопом анти-НВ , имеющего определенныйуровень радйоактивности.Выдерживают раствор, меченный радиоиэотопом анти-НВ , в контакте санионообменным материалом 30 мин -18 ч, предпочтительно 1-3 ч при 450 ОС, предпочтительно 40-50 С.Пропускают через колонку буфернуюжидкость с РН 5-8, предпочтительно6,5-7,5, чтобы удалить почти полностью меченный радиоизотопом анти-НВ,которйй не сорбируется анионообмен ным вецеством засчет связи с адсорбированным антигеном НВИзмеряют радиоактивность анионообменного материала.или элюата изпредшествующей стадии и сравниваютрадиоактивность, измеренную на предшествующей стадйи, с радиоактивностью,измеренной с использованием жидкойпробы, не содержацей значительногоколичества антигена НВз вместо сыворотки или плазмы,В качестве буферных жидкостей ис.пользуют фосфатный буфер, барбитальный буФер, трис-(оксиметил);амилометановый буфер, 4-(2-оксиэтил)-1"пиперазинэтанолсульфоновую кислоту (ГЭПЭС)и 1,4-пиперазин-бис-этансульфоновуюкислоту (ПИПЭС). П р и м е р 1. Подготовка аналитической колонки." Колонки содержат 0,5 мл анионообменной смолы, ДЭАЭ-целлюлозы типаОЕ, которую загружают в колонкуразмером 9,5 х 75 мм; йзготовленнуюиз полиэтилена, между двумя пористымиполиэтиленовыми дисками. Колонкуплотно закупоривают верхним колпакоми нижней крышкой .после того, как оназаполнена объемом 0,02 М раствора смеси моноосновного Фосфата натрия-двухосновного фосфата натрия, который выполняет функции буфера при РН 6,8.Буферного раствора должно быть достаточно,. чтобы произошло насыцение смолы и, кроме того, чтобы в резервуаребыл слой в 1 мм над уровнем смолы.Методика анализа,Снимают верхний колпак и колонкуукрепляют на решетке со стоком.В буфер, находящийся в резервуаревыше слоя ДЭАЭ-целлюлозной смоЛы, добавляют .200 мкл анализируемой пробыСыворотки или плазмы или отрицательного контрольного образца. Далее содержимое колонны перемешивают, чтобыперемешать, образец и буфер, а затемсмесь стекает при снятии нижнего кол-,,пака.Слой смолы промывают двумя последовательными добавлениями 4 .мп 0,02 Мраствора фосфатного буфера (РН 6,8).Когда жидкость из колонки полностьювытекает, сверху на слой смолы добав-.лЯют 200 мкл З -анти-НВз (УдельнаЯактивность мечеиого анти-НВз20 мкКи/мкг суммарная активность приблизительно 50.000 имп/мин). Радиоактивный препарат пропитывает смолу, после чего нижний колпак снова закрывают(анти-НВ, который используется вмес те с антйгеном НВ, очищают в соответствии со способом Линга и Оверби и метят по методу хлорамина Т) .Затем колонку инкубируют 2 ч при45 оС (анализ 2 ч 45 С) либо в течение 20 ночи при комнатной температуре 22 СС,Затем нижнюю крышку снимают и слойсмолы промывают двумя последовательными добавлениями 4 мл 0,02 М фосфат-ного буферного раствора (РН 6,8). 5 Когда жидкость из колонки удаляется полностью, нижнюю крышку ставят наместо и колонку помещают в гнездосчетчика гамма-излучения, такого, каксчетчик )апппасогй, при этом определяютрадиоактивйбсть слоя смолы.Проба считается положительной, если дает уровень радиоактивности, источником которой является слой смолы,превышающий (или дает уровень радиоактивности промывающей жидкости менее,чем) граничное значение, вычисляемоекак среднее количество импульсов/мингамма-излучения, источником которогоявляется слой смолы. 4 О Ниже приведен пример вычисленияграничного гамма-излучения (имп/мин)для слоя смолы. Семь аналогичных отрицательных контрольных проб подвергаютотдельно анализу и определяется количество (имп/мин) гамма-излучения, ис-45 точником которого является ,Аой смолы (пороговое значение имп/мин) длякаждого образца,Образец Пороговое значение,имп/мин+ 1808 5 12 х 1 15 . Отрицателная512 х 10 Пороговое значеграничное значение. нус мп мин) для п о 60 65 Следовательно, если подвергаемаяанализу проба дает пороговое значение, превышающее 1678 имп/мин,. топроба считается положительной на антиген НВз,П р и м е р 2, Радиоиммунносорбционный анализ на поверхностный антиген гепатита В в форме его иммунногокомплекса с антителом,Описывается методика обнаруженияантигена НВ, присутствующего в пробев комплексе в анти-НВ, т. е, в формеего иммунного комплекса. В соответствии с предлагаемым способом можно произВодить анализ пробы сыворотки наантиген НВ, содержащей анти-НВ , атакже производить анализ на антйгенНВЗ в Форме его иммунного комплексав соответствующих пробах. Колонки подготавливаЮт к анализамв соответствии с примером 1,Методика анализа. Нижняя крышка закрыта, а верхняя снята; из резервуара сливают фосфатный буферный раствор, а на его место заливают 1 мп 8 М Предлагаемый пример показывает, что можно обнаружить антиген НВь в присутствии эндогенного анти-НВъ,.Чтобы подтвердить присутствие антигена НВз в сыворотке, проводится и следование на центрифуге, Пробу сыво ротки, уравновешенную буферным раствором глицина (рН 2,0), обрабатывают сахарозным градиентом 5-20 (вес/вес Смесь подвергают разделению на цент" .Рифуге со скоростью 36000 об/мин 3 ч Фракции, которые извлекают из нижней части пробирки, при исследовании .по методике С(озгана на антиген НВ были определены как положительные. Это раствора карбамида в 0,02 М Фосфатномбуферном растворе (рН 68).В резервуар, содержащий смесь карбамид-буфер добавляют 200 мкл анализи-.руемой пробы сыворотки или плазмы илн.5 Отрицательной кОнтРОльнОЙ пробые СОдержимое колонки перемешивают,чтобысмешать образец и.смесь буфер-карбамид, а затем ему дают воэможность отстояться в течение 10 мин перед тем,как раствор слить, что осуществляетсяпри с н ятии нижней крышкиПосле того как раствор сливается,повторяются стадии, описанные в примере 1.ОбнаружЕние антигена НВ в сыворот ке (эндогенным анти-НВ ). Отрицательную контрольную сыворотку и обычнуюкоммерческую сыворотку, содержащуюнизкие концентрации антигена НВ и анти-НВ , подвергают анализу при йомо щи модифицированной методики со стадией инкубации 2 ч 45 С, методикиОазг 1 а, которая списана в предыдущем примере, и методики ОизаЬ"ФирьвЛабораториз Эбботт, Северный Чикаго.25 Результаты приведены в таблице. подтверждает наличие антигена НВ в сыворотке и ясно доказывает, что антиген НВз после отделения от анти-НВ на центрйфуге обнаруживается по методике бцзг 1 азз в то время, как он не бып обнаружен при помощи той же методики, когда находился в комплексе с анти-НВ .Обнаружение антигена НВ в форме его йммунного комплекса.Приготавливают ряд проб для анализа добавлением возрастающих объемов положительной сыворотки антигена НВз к постоянному объему анти-НВз сыворотки человека с высоким титром.Окончательные объемы уравнивают нормальной сывороткой, отрицательнойкак на антиген ЙВ, так и на анти-НВ,После инкубации в течение 20 ч образовавшийся осадок удаляют на центрифуге,а образовавшийся верхний слой используют в качестве анализируемой пробы.Каждая полученная таким образом пробаанализируется по методике РИ-АЙ, причем инкубацию осуществляют в течение2 ч при 45 ОС, по методике Оцэг 3.ад,а также по методике ОцзаЬ, Результаты приведены в таблице. Ау/Ав означает отношение объема положительнойна антиген НВь сыворотки, добавляемойк объему положительной на айти-НВФ сыворотки.По модифицированной методике РИ-Мантиген НВэ обнаруЖиваетсявГйрисутствии анти-НВ при самой низкой кбйПентрации добавляемого антигена НВ (Отношение Ас/Ав - 0,2).В пробах, в которых анти-НВэ присутствует в избытке (Ад/Ав Й 0,4)" пометодике Оцзг 1 ане удается обнару- -жить присутствие антигена НВЗ. С другой стороны, наличие анти-НВ подтверждается в пробах, имеющих отношения Ад/Ав меньшие или равное 1,0 пометодике ОцзаЬ; однакопометодикеОцзаЬ не удается обнаружить анти-НВв присутствии избытка антигена НВь(Ад/Ав ) 2,0),П р и м е р 3. Исследование адсорбционных свойств различных анионо, обменных вещестВ для антигена НВ.В диапазоне рН 5-8 исследоваласьспособность адсорбировать. антиген НВ.СлЬдующих анионообменных веществ: ДЭАЭ-целлюлоза, тип ДЕ, ДЭАЭ-Яер - Ьайехя,ОАЕ-Ьерьааех ДЭАЭ-В 1 оде 1 ф,Объем 200 млф Э-НВз антигена(25 мг/мл) добавляют в каждую иэ нескольких колонок,. содержащих различ- ные айионообменнйе"вещества при различных известных значениях рН. Далее каждую колонку промывают двумя объе" мами по 4 мл фосфатного буфера с соответствующими значениями рН. Затем определяют радиоактрвностьколонокпри:помощи счетчика гамма-излучения,Для каждой иэисследованных смолоптимальная адсорбция наблюдалась призначениях РН 6,0-6,5. ДЭАЭ-целлюлоза,ДЭАЭ-ЗЕрйайех и ЯАЕ-Берйайех имЕютвесьма, сходное максимальное "средствоадсорбции к антигену-НВ, тогда какДЭАЭ-ВходЖ А проявляет несколько более низкуюспособность к адсорбции антигена. При бслее широком исследовании было установлено, что ДЭАЭ-целлюлоза является предпочтительной смолой. для применения в колонках,.таккак не создает значительного сопротив =" " ления потоку через колонку и обладаетмщйимальной тенденцией адсорбироватьП р и м е р 4. Радиоиммунносорбционный анализ (РИ-Ад) на поверхностный антиген гепатита В,Описывается методика РИ-АЙ для обнаружения антигена НВ, отличающаясятем, что стадия промывки между стадией загрузки пробы и стадией добавле. -ния меченого анти-НВз, исключена.Каждый образец анализируют по методике РИ-Ай 2 ч 45 С с использованиемОдругой серииЛ -анти-НВ,П р и м е р 5. Использование гидрофобных адсорбентов в радиоиммунносорбционном (РИ-АЙ) анализа на поверхностный антиген гепатита В.Исследуют ряд М-аминоалкилзамещенных агароз в качестве адсорбентов всоответствии с методикой РИ-АЙ. Подготовка колонок и методика выполненияанализа описаны в примере 1, за исключением тоГо, что адсорбент ДЭАЭ-целлю 20 лозу заменяют раэличнымн о) -аминоалкилзамещенными агарами, а адсорбентйромывают двумя последовательными добавлениями 2 мп смеси таис,-оксиметиламинометан-хпоргидратный буфер и 0,5 М25 раствора хлорида натрия (рН 8,2). Двепробы сыворотки, одна отрицательнаяи одна пОложительная на антиген НВ,анализируют сиспользованием ряда колонок, причем каждая содержит одно изследующих веществ, имеющих общую формулуагароз-(СН), -ИН,где и - 4- 10 чйсло атомов углерода валкильной боковой цепиЮ -АминоалЪилэамещенные агарозыимеющие алкильные боковые цепи, содержащие более четырех атомов углерода,65 40 45 50 55 60 более предпочтительны для выявления,антигена НВП р и м е р б, Колонки подготавливают к анализу в соответствии с методикой примера 1.Снймают верхний колпак и колонкупомещают на дренажную решетку,В буферный раствор, находящийся врезервуаре над слоем ДЭАЭ-целлюлозы,добавляют .200 мл положительной сыворотки на антиген-НВз. Содержимое колонки перемешивают, чтобы смешать образец и буфер, затем содержимое колонки слнвают при снятии нижней крышки.Послетогокак содержимое колонкисливают, слой смолы промывают двумяпоследовательными порциями по 4 мл0,02 М раствора фосфатного буфера(рН 6,8) .Далее на верхний диск наносят слой200 мл. анализируемой пробы или отрицательного контрольного образца, которому дают возможность впитаться вслой смолы.Нижнюю крышку устанавлйвают на место и колонку инкубируют 2 ч при 45 С.Нижнюю крышку вновь снимают и сверху, на слой смолы наносят слой 2000 мл735153 Составитель С. МалютинаРед; ктор Е. Корина Техред А.Щепанская Корректор М. Пожо Заказ 2108/57 Тираж 673 . Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Филиал ППП Патент ф, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 щЭ-анти-НВ, и ему дают возможность впитаться в спой смолы. Йижнюю крышку снова эахрывают и колонку инкубируют еще 2 ч при 45 С..Нижнюю крыаку снова снимают и слой смолы проьывают двумя последовательными порциями по 4 мп 0,02 М раствора фосфатного буфера (рН 6,8)Когда содержимое колонки полностью стечет, нижнюю крьвку вновь закрывают и измеряют радиоактивность колонки при помощи счетчика гамма-излучения,Предлагаемый способ является более чувствительным и позволяе. быстро и точно выявить поверхностный антиген .гепатита В в исследуемой пробе.. Формула изобретенияСпособ выявления поверхностного антигена гепатита В в исследуемой пробе сыворотки крови или плаэмю путем оп- ределения разности радиоактивности сыворотки, содержащей специфические меченые антитела, до и.после ее контакта,с фиксированным на инертном носителеантигеном гепатита В, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с .целью повышениячувствительности способа, исследуе мую пробу пропускают через колонку,заполненную анионообменным материалом в форме частиц, которые находятся в равновесном состоянии в жидкостипри рй 5 - 8, промывают колонку при рН5-8, затем пропускают меченные радиоактивным изотопом специфические антитела с заранее определенным уровнем радиоактивности, инкубнруют в течение 0,5-18 ч при 4 - 50 С, затем колонку промывают при рН 5-8 и опреде ляют радиоактивность анионообменногоматериала илиэлюата из предыдущейстадии. Источники информации,щ принятые во внимание при экспертизе 1. Патент США 9 3938853,кл. 308-4, опублик. 1976.