Способ определения пирувата в биологических объектах

СОЮЗ СОВЕТСКИХСЦЧЗИПТИЩСЩРЕСПУБЛИК ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕАТЕНТУ Я шение стабильности и достоверности результатов определения за счет предотвращения образования осадков и помутнений. Способ заключается в том, что в состав реактива для определения целевого продукта входит пируватоксидаза, характеризующаяся оптимумом активности при рН 5,7, оптимумом стабильности при рН 5,6-5,8, константойо Михаэлиса для пирувата при 25 С 0,4 ммоль/л, для фосфата 2,3 ммоль/л, мол.м 146000 дальтон при определении в центрифуге по А е , выделенная из штаммов молочно-кислых бактерий Ьа ссоЬао 111 цз РБМ 2671, ЬЬс. ва 11 чаг 1- цв РБМ 2573, Ьецсопозгос шезепСегоИев РБМ 2572 и/или Бсгергососсцв сгешогаз РБМ 2574. 4 табл. ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ(71) Берингер Маннхайм ГМБХ (РЕ)(72) Эрих Элстнер, Карл-Хайнц Шлейфер, фридрих Гец, Барбара Зедевиц,Альберт Редер, Ханс Меллеринги Ханс Зайдель (0 Е)(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПИРУВАТА ВБИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ132298Изобретение относится к биохимии и биотехнологии и касается получения фермента, пригодного для количественного определения пирувата и пирунатобразующих ферментов, 5Цель иобретения - повышение стабильности и достоверности результатов определения за счет предотвращения образования осадков и помутнений,Способ определения пйрувата в био логических пробах заключается в том, что в состав реактива для определения пируната входит фермент пируватоксида, актинный беэ добавления флавинадепиндинуклеотида (РАЭ), тиамин-пирофосфата (ТРР) и двухналентных ионов металлов. Пирунатоксидаза оптимально активна при рН 5,7, оптимально стабильна при рН 5,6-5,8 и, что особенно важно, при применении фермента кон станта Михаэлиса равна 0,4 ммоль/л для пируната и 2,3 ммоль/л для фосфата, мол.м. фермента 146000 дальтон, что меньше известного фермента (190000).Полученный фермент более специфичен к субстрату по сравнению с известным.Характеристики специфичности представлены н табл. 1.30Влияние ингибиторон на активностьпредлагаемого фермента, используемогодля определения пируната, показанон табл.2,35Ингибирующее действие ЕДТА напредлагаемую пируватоксидазу в 1000 раз слабее, чем н случае известного фермента, а после многодненного диализа фермента благодаря добавке ТРР, 40 ГАР и Мп активность повышается на 5-157., в то время как известный фермент без этих активаторов неактивен.В качестве источника фермента используют штаммы молочно-кислых бак терий ЬасоЬасд 11 цв р 1 апгагцш ОБМ 2571, ЬЬс. Ба 11 чагьцв РБМ 2573, ЬецсопонЬос шезепгегоЫев 0 БМ 2572 и/или Бггергососсцв сгешогв ПБМ 2574, хранящиеся в Национальной коллекции микроорганизмов.Обогащение и очистку фермента осуществляют обычными биохимическими метолами. Можно достигнуть 20-30-кратного обогащения до достижения удельной активности 6-9 ед/мг протеина.Полученная пируватоксидаэа входит в состав реактива для определения пирувата в анализируемых пробах. 4 2Предпочтительный состав реактива:1-50 ед/мл пирунатоксидазы, 1 О50 ммоль/л фссфата, буфер рН 6-8 (любое пригодное буферное нещестно, буферирующее в указанных рН-областях,н которых фермент активен и стабилен), Хорошо пригоден фосфатный буфер и 0,22 ед/мл пероксидаэы (РОД).Использование в составе реактивапредлагаемого фермента обеспечиваетболее высокую способность его к хранению,Выделение пируватоксидазы (Ру-ОП)из ЬасгоЬасд 11 цз р 1 апгагцш РБМ 2571осуществляется следующим образом.1. Культиниронание. Среда длякультиниронания содержит, г/л воды:бакто-триптон-оксоид 10;дрожжевой экстракт оксоида 4; КНРО х 3 НО 2;диаммоний-гидроцитрат 2; твин(полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат)1 мл; МВБО 4 х 7 НО 0,2; МпБО, хх НО 0,2; сульфид молибдена 0,2;лактоза 10; пировиноградная кислота3,2; рН 7.150 мл среды указанного составаили обычной для бактерий молочнойкислоты МКБ-среды засевают культурами путем укола и встряхивают при28 С. После происшедшего роста150 мл указанной среды засевают 157выращенной культуры и встряхивают вколбе Эрленмейера емкостью 500 мл прио28 С вплоть до завершения позднейлаг-фазы.МНБ-среда составляется следующимобразом, г/л: мясной экстракт(МЕНИСК) 2; пелтон из казенка 10;ггур 1 зй дрожжевой экстракт 4; глюкоза 20; твин1 мл; КНРО 4 хЭ Н 02,5; Ма-ацетат х 3 НО 5; диаммонийцитрат 2; М 8 БО 4 х 7 Н 0 200 мг;МпБО х Н О 50 мг.2. Выделение. Из 50 л культуральной жидкости ЬасгоЪас 111 цн ОБМ 2571со 120 ед/л пируватоксидазы (Ру)собиают 300 г влажной массы путемцентрифугирования. 100 г клеток помещают н стеклянную диномельницу,после добавки 4 Е полиэтиленимина центрифугируют и надосадочную жидкостьобрабатывают фракционированием сульфатом аммония (25-657) при рН 6,3,хроматографированием с помощью декстранблау-сефарозы (фирма Гагшасда),второго фракционирования с помощьюсульфата аммония при 20-303 (насыщения) и путем пропускания через мо1322984 4 Очищенный фермент имеет удельнуюактивность 5,8 ед/мг и содержит менее чем 0,03 Е Аро-глутамат-пируваттрансаминазы +О -кетоглутаратоксидазы, а также менее 0,0027 ЯАЭН-оксидазы,Активность пируватоксидаэы определяют при следующи условиях:пируват + Р,От Р - ОО ацетип 15НаО + 4-аминоантипирин (4-АА) ++ 2 окси,5-дихлорбензол сульфокислота (НРВБ) РОВ хиноновый краситель(546 нм) + 2 Н О.НЗ потребляется эквимолярным ко личеством красителя.1 ед. Рувв 1 мкмоль превращеОния пирувата в 1 мин при 25 С.Определение пирувата: 72 ммолькалийсофатного буфера, рН 6,7; 258 ммоль 4-АА; 6,8 ммоль/л НПВБ;0,01 ммоль/л ГАО; 2 ед. РОО; 10 ед.Ру-ОП на 1 мл. Старт для последовательности до целевого значения осуществляется путем добавки 0,05 мкмольЗОпирувата, соответственно содержащейпируват-пробы, в кювету объемом 2 млпри толщине слоя 1 см и температуре37 С.Реакция спустя 15 мин прекращае-я 35Коэффициент экстинкции при 546 нм16,5 см (мкмоль измеряется длячистого пирувата - мононатриеваясоль),40П р и м е р 1. Кинетическое определение пирувата (СРТ).К 2,5 мл раствора, содержащего,ммоль/л: КН РО (рН 6,7) 80; алании/800; М-(3 -сульфонил-окси-хлорфенил)-4-аминоантипирин 0,2; х -кетоглутаровая кислота 18, а такжепируватоксидаза 0,2 ед/мл; пероксидаза 2 ед/мл, добавляют 0,1 мл пробы.Спустя 3 мин определяют изменениеэкстинкции в 1 мин. Температура измеОрения составляет 25 С, длина волны546 нм, с составляет 19,6, общий объем 2,6 мл и объем пробы 0,1 мл. Иэприроста экстинкции в 1 мин рассчитывают активность на СРТ.П р и м е р 2. Кинетическое определение СОТ. В исходную смесь, аналогичную примеру 1, которая вместо ала 3лекулярное сито Сефадекс АСА (фирмы .КВ)Данные обогащения представлены в табл.3. нина содержит 200 ммоль/л аланинсульфиновой кислоты, в тех же условиях,как и в примере 1, добавляют СОТ-содержащую пробу. Из иэмедения экстинкции в 1 мин рассчитывают содержаниеСОТ.П р и м е р 3. Тест-полосы дляСРТ.Для приготовления тест-полос СРТпропитывают две бумаги.ферментная бумага: 0,5 моль/л морфолинэтансульфокислота (гидроксидкалия, рН 6, 5 (МОКБ-буфер); 800 ммоль/лаланина; 1 ммоль/л гидрофосфата калия; 20 000 ед/л РОП; 200000 ед/лпируватоксидазы.С помощью этого раствора пропитывают адсорбирующую бумагу толщиной50 ммк, с поверхностной плотностью12 г/м , поглотительной способностью50 г Н Э/м , и высушивают в течение5 мин при 30 С (например, ситчатаябумага для чая ТееЬецСе 1 рар 1 ег фирмыБсЬо 11 ег апд Ноясп). Бумагу затемразрезают на полосы шириной 1 см.Индикаторная бумага: О ммоль/л4,5-(4-диметиламино-фенил)-2-(3,5-диметокси-оксифенил) имидазолаи 18 ммоль/л 6 -кетоглутаровой кислоты растворяют в 100 ммоль/л НС 1 (буферная система),С помощью этого раствора также пропитывают соответствующую адсорбирующую бумагу, высушивают в течениеО5 мин при 30 С и разрезают на полосы шириной 1 см. Прозрачную поликарбонатную пленку толщиной 10 ммк вместе с индикаторной бумагой и ферментной бумагой наносят с одной стороны на пластиковые полосы (ленты), укрепляют так, что пленка прилегает снаружи, индикаторная бумага в середине, ферментная бумага внутриНаряду с этим наносят шириной 15 мм прочес из стекловолокна, толщиной 1,5 мм, с толщиной волокон примерно 2 мкм, так что свободный конец пленки и пропитанная бумага выступают еще на 6 мм над прочесом (ваточным холстом). Затем все разрезают на тест-полосы шириной 6 мм. Если наносят 15 мкл цельной крови на участок для нанесения пробы, то в течение 45 с доля плазмы проникает через стекловолокнистый прочес под прозрачную пленку, в то время как эритроциты удерживаются на месте нанесения. После прижатия пленки ферментная и индикаторная бумаги) 322984 Таблица 1 Субстрат 100 100 Пируват Ы-Кетобутират Ацетальде 15 гид Метилглиоксаль соприкасаются с освободившейся плазмой и равномерно увлажняются. Содержащийся в плазме пируват (СРТ) реагирует с синям окрашиванием, интенсивность которого пропорциональна количеству (измерению) СРТ и при известных условиях моает измеряться в ремиссионном фотометре. Таким ке образомреагируют другие испытуемые материалы, такие, как сыворотка, плазмаи т.д.П р и м е р 4, Тест-полосы на СОТ,Тест-полосы на СОТ готовятся такае, как и полосы на СРТ согласно примеру 3, тоЛько в ферментиой бумаге 15вместо аланина содеряатся 200 ммольаланинсульфокислоты, Получающеесяпосле прккатия прозрачной пленкисинее. окрашивание является мерой количества СОТ в пробе. 20П р и м е р 5. Сравнение результатов измерений при применении предлагаемого способа и известного послехранения примененных реактивов.Для сравнения применяют: 25реактив по примеру 3;реактив по примеру 3, но бумагувместо 200 000 ед/л предлагаемой пируватоксидаэы пропитывают 200 000 ед/лизвестной пируватоксидазы, а такыре З 0дополнительно 1 ммоль/л пиаминпифосфатом (ТРР) и 0,5 ммоль/л Мп-ионовПри помощи этих реактивов исследуют Э пробы с пируватом до и послехранения, которые показывают различную активность СРТ. Измерение проводят согласно примеру 3,Результаты испытаний представленыв табл.4.40 Из табл.4 следует, что по предлагаемому способу и после хранения реактива для определения пирувата величина измеряемых значений существенно не отклоняется от базового значения, в то время как согласно известному способу результаты измерения послео хранения в течение 3 дней при 60 С отклоняются от базовых значений до 607.50Аналогичные результаты получают и в том случае, если вместо реактива для определения пирувата согласно примеру 3 используют реактив согласно примеру 1, который перед хранением лиофилизируют. Таким образом, предлагаемый способ определения пирувата в биологических объектах обеспечивает достоверность результатов. Способ пригоден и для определения субстратов н ферментов, который приводят к образованию пирувата. ф о р м у л а и з о б р е т е н и я Способ определения пируата в биологических объектах, предусматривающий взаимодействие исследуемой пробы с реактивом, содержащим пируватоксидазу, буфер, пероксидазу, 4-аминоантипиран, и сульфокислоту, последующий анализ его количества путем регистрации образующейся перекиси водорода, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения стабильности и достоверности результатов определения за счет предотвращения образования осадков и помутнений, используют пнруватоксидаэу, выделенную нз молочно-кислых бактерий атаииов 1 асСоЬас 111 цв р 1 апйагцв 08 М 2571, или ЬЬс. ва 11 чагдцв РВИ 2573, или 1 ецсоповЬос с 3 ееепгегойев 0 ЯМ 2572, или БггерСососсов сгепюгдв ЫМ 2574, характеризующуюся оптимумом активности при рН 5,7, оптимумом стабильности при рН 5,6-5,8, константой Михазлиса для пирувата при 25 С 0,4 ммодь/л, для фосфата 2,3 ммоль/л, мол.м. 146000 дальтон прн определении в центрифуге по Аее Специфичность к субстрату,Х Предлага- Известнаяемая480 2516 6700 0,37 100 2436 5540 0,44 97 98 2284 2560 0,89 91 748 753 1,0 590 102 5,8 13 30 30 23,5 Беэ ингибиРастворение - надосадонная яждкость фракционирование ссульфатом аммония декстранблау-сефароэа фракционирование ссульфатом аммония АСА 34-мол-сита ция,ммоль/и Протеин,мг Удельная Выход, Х1322984 1 ОТаблица 4 Активность СРТ, ед/л Проба Базовое 1 без 1 3 дня 11 без 3 дняО означениенагрузки при 60 С нагрузки при 60 С 29 60 209 Составитель И.ПриваловаТехред М.Моргентал Корректор А. Тяс Редактор Н.Тупиц аказ 2883/5 Подписноео комитета СССР Тираж 499 ВНИИПИ Государственн по делам изобретен 113035, Москва, Ж, и открытийаушская наб.,д.4/ Производственно-полиграфическое предприятие, г,ужгород, ул.Проектная,