Способ определения субстрата или фер-ментативной активности b биологическомматериале

Союз Советских Социалистических Республик(3) Р 26 25 834,4 (33) ФРГ Государственный комитет СССР по делам изобретений и открытий(088.8) Дата опубликования описания 1701,81 ИностранцыИозеф Даннингер, Ульферт-денеке, Гунтер Ланг, Герхард Михали Петер Решлау(72) Авторы изобретения Иностранная фирма(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУБСТРАТА ИЛИ ФЕРМЕНТАТИВНОИ АКТИВНОСТИ В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ Изобретение относится к биохимии, в частности к способам определения субстрата или ферментативной активности.5Известен способ определения субстрата или ферментативной активности в биологическом материале путем проведения окислительно-восстановительной реакции 11 .30Однако известный способ не позволяет провести точные определения, поскольку в биологическом материале имеются другие восстановительные вещества, которые создают помехи. Наиболее часто встречается аскорбиновая кислота, которая нарушает течение окислительно-восстановительных реакций с использованием КО образующего фермента, тетразолия или Фенола.Цель изобретения - повышение точности способа определения.Поставленная цель достигается тем, что в реакционную смесь вносят аскорбатоксидаэу в Количестве 100 Ед/мл исходной смеси, а учет реакции ве" дут по образованию окрашенного продукта.Кроме того, для получения окрашенного продукта аскорбатоксидаэу вводят одновременно или с НрОо. образующим ферментом, или с солью тетраэолия или же с феьолом.Используемую аскорбатоксидазу можно получить иэ ЕцссЫ п 1 (СцсцгЬцеареро аедц 11 ова),Предпочитаемыми методами для предлагаемого способа являются определение глюкозы с пероксидаэой или глюкозаоксидаэой и о-дианизидином или2,2-азино-ди-этилбензтиазс инсульфонатом (АВТ 5), определение глюкозыпо методу гексокинаэы глюкоза-фосфатдегидрогеназы), обнаружение мочевой кислоты посредством Фенола, аминоантипирина, пероксидаэы и уриказы,определение тироэина или пирокатехина посредством 5 МВТН (4-метил-б-калийсульфонил-бензтиазолонгидраэона(2 )и тирозиназы или диФенолоксидазы.П р и м е р 1. Определение глюко.зы с о.-дианизидином, пероксидазой,,0 что 0,00573 или 0,000573 аскорбатапрактически полностью тормозят тестдо 41,5,кюветы 4 и 5-пок.зываютполное устранение нарушения этихконцентраций аскорбата добавкой по0,0003 аскорбатоксидазы.5П р и м е р 2 Обнаружение глюкозыс 2,2,-азино-ди(3-этил-бензтиазолинсульфонатом(б) ) (АЗТВ), РОЗ и ЯОЭ вфотометре, с длиной волны 432 ни, стемпературой измерения 250 С ( см.табл. 2,Кювета 1 соответствует ненарушенному измерению (нет аскорбата). Кюветы 2 и 3 показывают, что 0,000573или 0,0000573 мол. аскорбата полностью тормозят тест до 2,1,Кюветы 4 и 5 показывают полноеустранение нарушения этих концентраций аскорбата добавкой по 0,0003аскорбатоксидазы,П р и м е р 3. Обнаружение мочевой кислоты посредством фенола, аминоантипирина, РОО и урикаэы на аналитическом автомате (Яцко Апа 1 уаг).Принцип теста; Мочевая кислота ++ 4-аминоантипирин - зхинодный кра"ситель + 2 Н 10Изготовление растворов.Реактив аскорбатоксмддзы. В 600 мп Збидистиллированиой воды растворяетсясодержимое Флакона 1. Добавка О,З млВг Ц, Затем смесь выдерживаетсяв темном Флаконе приблизительно щж40 С четыре недели,при 25 оС одну не делюРеактив уриказы, В 800 ил биднстиллированной воды растворяется содержимое Флакона 2, Добавка 2,0 млВг(-35. Затем смесь выдерживаетсяв темном Флаконе приблизительно при 494 оС четыре недели, приблизительнопри 25 ОС одну неделю,Концентрация растворов.0,63 Фосфатного буферного раствора, рН 5,6.0,35 трис/лимонной кислоты,рН 8,9, уриказы ) 0,001,РОО0,000015, 0,05 2,4-дихлорфенола, 0,08 4-аминоантйпирина.П р и м е р 4Обнаружение глюкозы с НК/Я бР-ОА, МАРР, (МТ и диа-,Форазой в Фортометре. Измеряемая длина волны 492 нм, температура инкубацин 25 оС (см. табл. 3) .Кювета 1 соответствует ненарушенному измерению, Кювета 2 показывает, что 0,0000573 аскорбата может тормозить тест на 34 кювета 3 пока 1зывает, что 0,0003 аскорбатоксидазы полностью устраняет это нарушение. П р и и е р 5. Определение глутамата посредствои диафоразы в фотоиетре. Измеряемля длина волны 492 нм,температура 25 оС(см. табл. 4).Кювета 1 соответствует ненарушенному измерению,кюветы 2 и 3 показывают, что0,0029 нли 0,00029 аскорбататормозят тест на 700 или на 100.Кюветы 4 и 5 показывают полноеустранение этого нарушения добавкой0,00006 аскорбатоксидазы. П р и и е р б. Определение тирозина с 3-метил-б-калийсульфонил-бензтиазолон-гидразоном-(2)(БМВТН) и тнрозиназой в Фотометре, измеряемая длина волны 492 ни, измеряемая температура 25 оС(си, табл. 5),Кювета 1 соответствует ненарушенному измерению, в кювете 2 0,0057 аскорбата снижает теоретическую величину на 35, в кювете 3 это нарушение полностью устраняется добавкой 0,003 аскорбатоксндазы. П р и и е р 7. Определение ниракатехина с БИВТН и дифенол-оксидаэой(см, табл. 6) .Кювета 1 соответствует ненарушенному измерению,В кювете 20,01145 аскорбата снижают теоретическую величину на 47,это нарушение полностью устраняетсяв кювете 3 добавкой 0,0003 аскорбатоксидаэы. Полученный способ позволяет полностью устранить вызванные ошибки наличием аскорбиновой кислоты при проведении окислительно-восстановительных реакций.797592 Продолжение табл. 1 вета Компоненты Растворглюкозы, 0,172 0,03 0,03 0,03 003 0,03 Раствор аскорбиновойкислоты М 0,1 0,01 0,1 Оф 01 0,02 0,11 - . 0,09 0,12 Вода 0,02 . 0,02 Аскорбатоксидаза500 ед./мл, 0,05 Инкубация 1 мин при 25 ОС, считывание Е, затем начинается реакция с 000 0,0333 О,г О,г 0,1 0,1 Инкубация 30 мин при 25 оС,считывание Е ,вычисление из Д -Е =ЬЕОф 541 0 еого О ф 31 б Ок 540 Ою 543 ДЕ Таблица 2 осфатныаствор 7 2,7,75 5 0 ВТБ 0,0 0 О,люкоэы, 0,0172 ств Раство кислот аскорбиновой 1 ммоль 0,01,. 02 02 0,02 орбатоксидата,005 акции вычисление из Е-Е, = д 5 оС считыва нкубация 30 мин 02 0,504 ООО О,4 О 0 буферныйРН 5,6 1,36094 нкубация 1 ми0,0333 0,0 0,0 0,1 25 СС,считывание Е, начал 0,1 0,1797592 Тасяия 3 Компо Кюве Фосфатный буфернрН 7,5, 1,36 аствор АОР 1 МТ по 0 а 5 Е/мп, 0,1глюкозы, 0,005аскорбата 0,17 иа ор 0 во аст токси,04 0,0 Во мин при 2 Инкуб/66 Р-ОН-раствор по 0,14 4 нкубация 15 мин, считывание Е, вычисление из Е-Е = Ь 0,234 0,307 0,230 абл ый буферный раствор 0,14 1 фосфа рН 5,1,20,29 27 амата, 0,02 рбата, 0,086 дазЪ, 0,01 0 0 О,0,1 корбатокс и 25 С, затем раствор набирается пипетк в отдельные кюветы Инкубация 3 ми Калийфосфатны буферный раст рН 8,6 с 1,5 тритона-Х,05 0,0 О, 0. 5 0 Раствор глРаствор а МАО-растворРаствор диа 0,1 0,1 0,1 0,1 0,01 0,03 считывание Е на ало реакции с 0,05 0,05 0,05 0,1 0,10,1 001 0,02 0,02797592 Продолжение табл, 4 Кювета Компоненты Считывание Е , начало реакции с 0,050,05 0,05 1 Т - раствор 0,2 0,05 0,05 Инкубация 15 мин при 25 С, считывание Е вычисление из Е -Я = А Ео Таблица 5 77 2,7 ТН 0,1 0 5,05 эиназа, О,бация 1 ри 25 ОС считывание ач еакции с,0 0,036 тирози час при 25 С считывание Е, вычисление из Е-Е кубаци 728 1,100 лица 6 68 2 ф 05 0 3 МВТН 0,1 0 ирокатехин, 0,0056 ата 20 ммоль ство ксидаза 500 Е/мл Аскорб Фосфатн раствор Фосфор раствор ферный, ,2, 3,4 буферный рН 5,2, 3,4Продолжение табл,ь Кювета Компоненты Инкубация 1 мин при 25 ОСР СЧитывание Ез, НаЧаЛО рЕаКцИИ С дефенолоксидаэа, 0,2 0,05 0,05 0,05 Инкубация 17 мин при 25 С считывание Е, вычисление из Е -Е = ЬЕОЯ 1 ЬЕ 0,890 0,485 Г,896 Формула изобретения Составитель МорозоваТ д . сталош Ко екто И. Муска РедакторЗаказ 982 539 ВНИИПИ Государственного по делам изобретений и 113035 Москва ЖРаПодписноемитета СССРкрытийсная наб., д. 4 пПатентзз, Проектная Ужгород филиал 1Способ определения субстрата или ферментативной активности в биологическом материале путем проведения окислительно-восстановительной реакции, о т л и ч а ю щ и й с я тем,что, с целью повышения точности способа, в реакционную смесь вносят аскорбатоксидаэу в количестве 100 Е/мл исходной смеси, а учет реакции ведут по образованию окрашенного продукта.2. Способ по п,1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что для получения окрашенного продукта аскорбатоксидазу вводят одновременно с Н 099 образукщим ферментом. 3. Способ по п.1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что для полученияокрашенного продукта аскорбатоксн О даэу вводят одновременно с сольютетразолия.4, Способ по п., о т л и ч а ющ и й с я тем, что для полученияокрашенного продукта аскорбатоксидаэу вводят одновременно с фенолом.5, Способ по п.1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что используют аскорбатоксидазу иэ 7 оссЬ 1 п (СцсигЬцсареро ееби 11 оэ.а). 30, Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Восйе 9 п 1 са 1 Соррег Ргосее 61 п 9Иагг 1 п 2 еа, И,Ч. 1965, с. 305-337.