Способ выделения целлюлазы

(72) Авторы взобретеив я бинович, А.Р. Клесов, и В.А, Иартьяно Берези ягкихлюцииый 1 осковский ордена Ленина, ордена Октябрьск и ордена Трудового Красного. Знамени госудауниверситет им. И.В. Ломоносова(54) С ВЫДЕЛЕНИЯ ЦЕЛЛОЛАЗЫ м к предлагаемомуности и достигаемо-,ется способ выделе-. по му Изобретение относится к способам выделения ферментных препаратов микробного происхождения и может быть, в частности, использовано для получения высокоактивных препаратов целлюла/зы, применяемых в пищевой промышленности, виноделии и медицине.Известен способ выделения ферментов, в том числе целлюлаз, из растворов, предусматривающий осаждение сульфатом аммония из сконцентрированного упариванием раствора 1 .Недостатками этого способа являются сложность регенерации осаждающего агента и низкое содержание целлюлаз в получаемых препаратах, поскольку вместе с целлюлазами происходит осаждение посторонних белков, углеводов, компонентов питательной среды и других примесей.Наиболее близкитехнической сущрезультату явля ния целлюлазы иэ содержащих ее раст"воров, предусматривающий адсорбцию фермента из охлажденного до 5-15 С раствора с рН 3-6 на сорбент, представляющий собой измельченную целлюлозу (обычно с размером частиц 10- 100 мкм, взятую в количестве 0,1-10 г на 50 ед. активности фермента), последующее фильтрование,суспензии и сушку отделенного сорбата2.Недостатками известного способа являются невозможность получения препаратов, содержащих более 500 ед, целлюлазы на 1 г, и низкая начальная активность получаемых препаратов при использовании для переработки твердых видов растительного сырья, поскольку при добавлении их к сырью первоначально происходит гидролиз сор" бента, на который осаждались целлю" лазы, и лишь затем возможен гидролиэ самого перерабатываемого сырья.975796 3Цель изобретения - повышение активности целлюлазы.Поставленная цель достигается спо" собом выделения целлюлазы, предусматривающим адсорбцию фермента на целлюлозе при рН 3-6, причем адсорбироеанный фермент элюируют водой или буферным раствором с рН 4,5-7,5 и ионной силой 0,0001-0,01 М с последующей сушкой полученного элюата. .1 оОбычно используют культуральную жидкость продуцента целлюлазы или экстракт поверхностной культуры, или раствор технического препарата целлюлазы. 15В качестве адсорбента обычно используют хлопковый линт или некондиционный хлопок. Перед элюцией фермента с целлюлозыобычно осуществляют отмывку адсорбироеанных примесей буферным раствором срН 3,5-4,5 и ионной силой 0,01-2 И.Обычно процесс ведут при 1-25 С.Использование воды или водногораствора с малой ионной силой для смывания адсорбироеанной целлюлаэы явля"ется неочевидным, поскольку уменьше"ние прочности адсорбции Ферментов,как правило, вызывается повышением,а не понижением ионной силы, поэтомуповедение целлюлаз в данном случаеявляется исключением.Близкие результаты, достигаемыепри использовании чистой воды и водных растворов с ионной силой 0,0001"0,01 И, объясняются тем, что водаобладает большей способностью к смыванию целлюлаз, но при ее использова"нии сильно увеличивается гидродинамическое сопротивление целлюлозы, чтоможет приводить к уменьшению скоростиэлюироеания почти до нуля еще до то"го, как весь фермент десорбируетсяс целлюлозы. Это может приводить кснижению выхода целлюлазы при исполь- фзовании в качестве адсорбента порошковых форм целлюлозы типа микрокристаллической, Водные растворы с ионнойсилой 0,0001-0,01 М, хотя и обладаютнесколько меньшей способностью к смы- ЗЕванию целлюлаз при пропускании равного объема, однако в меньшей степениповышают гндродинамическое сопротивление порошковых форм целлюлозы, благодаря чему элюцию ими можно прово" Ядить до полного отмывания целлюлаз.Способ осуществляется следующимобразом,4Перед выделением Фермента рН ферментного раствора доводят кислотой, например уксусной, до 3-6, а ионную силу - подходящей солью, например цитратом натрия, ацетатом натрия, хлоридом калия и т.п. - до 0,0001- 0,01 М. Раствор фермента пропускают через охлажденную до 1-25 фС колонку, заполненную целлюлозой, со скоростью 0,1-5 свободных объемов в час. По окончании пропускания раствора Фер" мента пропускают буферный раствор с рН 3,5-4,5 и ионной силой 0,01-2,0 И (1-10 объемов), а затем - воду или водный раствор с рН 4,5-7,5 и ионной силой 0,0001-0,01 М. Водную фракцию (1-3 свободных объема колонки) собирают и при необходимости (наличии осадка или сильной опалесценции) фильтруют или центрифугируют для удаления осаждающихся примесей, а затем сушат лиофильно.Полученный препарат целлюлаэы содержит 1000-10000 ед. Фермента на грамм и почти не содержит пигмента, балластных белков, протеаз, солей и других примесей. В качестве примеси он содержит небольшие количества растворимых сахаров (глюкозы и целлобиоэы), стабилизирующих фермент при хранении. Ферментный препарат легко гидролизует растворимые производные целлюлозы, а также природную целлюлозу (хлопок, отходы древесины и т.д.). Выход по ферменту составляет 80"1003,.Колонку с целлюлозой можно использовать для выделения целлюлаэ 1 О и более раз беэ ухудшения ее сорбционных свойств, пополняя периодически целлюлозой взамен прогидролизованной ферментом. О качестве сорбента можно использовать микрокристаллическую целлюлозу для хроматографии, измельченный и неизмельченный коротковолокнистый хлопок (линт), отходы производства бумаги, отходы вискозной промышленности. П р и м е р 1. 2 г технического препарата целловиридина ГЗх (продуцент Тг 1 сподегеа ч 1 г 1 де) с активностью 30 ед/г (по КМ-целлюлозе) растворяют в 20 мл О,1 И ацетатного буфера с рН 35 и ионной силой 001 М при перемешивании в течение 20 мин, затем удаляют центрифугированием нерастворившиеся примеси. В колонку объемом 10 мл (150 М 10 мм) с водяной75796 4 П р и м е р 3 Готовят 104-ную водную вытяжку поверхностной культуры Тг 1 сЬодегца 1 соп 1 п 011(препарат целлоконингин Пх, удельная активность 10 ед/г), как описано в примере 1. Добавляют в нее КН РОл, до рН 6 и ионной силы 2 М. В колонку, использованную в примере 1, термостатируемую при 25 С, вносят 8 г неизмельченного некондиционного хлопка, промывают 2 М раствором КН РО, затем пропускают 80 мл целлюйазного раствора, аИ затем воду. В первых 20 фмл водной фракции фермента почти нет. Их отбрасывают. и собирают следующие 20 мл, которые сушат лиофильно. Выход фер 5 9руоашкои, охлажденной до 15 фС, вносят 4 г микрокристаллической целлюлозы для колоночной хроматографии(производство СЬепаро", ЧССР) и уравновешивают упомянутым буфером. Адсорбцию целлюлазы проводят пропусканием20 мл 104-ного раствора целлелаэногопрепарата через колонку со скоростью10 мл/ч. Раствор, не содержащий фермента, удаляют из колонки вытеснением упомянутым ацетатным буфером. После пропускания 100 мл буфера его заменяют на водный раствор одноэамещенного фосфата натрия с ионной силой 0,001 М и рН 7, собирают выходящую фракцию объемом 1 О мл и сушат еелиофильно. Выход фермента составляет804. Получают 16 мг препарата с активностью 3000 ед/г,П р и м е р 2, Готовят 104 л,"рыйраствор технического препарата целлобронина Г 10 х с удельной активностью100 ед/г (продуцент Тг 1 с 11 одегша 1 оп 91 ЬгасЬ 1 айцп) в 0,1 М ацетатном бу фере (рН.,4,5, ионная сила 0,04,М),как описано в примере 1, В колонку(70025 мм, объем 300 мл) с водянойрубашкой, охлажденной до 1 С, вносят100 г хлопкового линта, измельченного в течение 5 мин на лабораторнойвибромельнице, и уравновешивают упо=мянутым буфером. Пропускают 350 млраствора целлобронина, затем 400 млацетатного буфера, 200 мл О,1 М фосФатного буфера (рН 7,5, ионная сила0,2 М) и, наконец, воду со скоростью50 мл/ч. Собирают водную Фракциюобъемом 120 мл, центрифугируют дляудаления выпавших в осадок примесейи сушат лиофильно. Выход Фермента1003. Получают 600 мг препарата с ак"тивностью 6000 ед/г.% 1 О 3 3 И 30 33 мента 804 или 60 мг препарата с ак"тивностью 1000 ед/г.П р и м е р 4. В культуральнуюжидкость продуцента Тг 1 сЬодегиа 119 погош с активностью 0,4 ед/мл добав"ляют концентрированную уксусную кислоту и ацетат натрия из расчета 0,1 Мацетатного буфера (рН 4,5). Для выделения целлюлаэы иэ культуральнойжидкости повторно используют колонкус измельченным линтом из примера 2,отмытую водой и уравновешенную ацетатным буфером. На колонку наносят1 л культуральной жидкости, далее поступают, как в примере 2. Выход фермента 95 или 95 мг с активностью4000 ед/г,П р и м е р 5. В 100 мл 13-ного,раствора прейарата целлокандинаГ 10 х (продуцент СеоСг 1 сЬцп сапд 1 дцв)с удельной активностью 100 ед/г в0,1 М ацетатном буфере с рН 4,5, использованного для гидролиза растворимой КМ-целлюлозы и содержащего продукты гидролиэа, вносят при перемешивании и охлаждении до 5 С 15 г порошковой целлюлозы с размером частиц150-250 мкм. Перемешивают 20 мин,затем раствор, не содержащий фермента, удаляют фильтрованием нд стеклян"ном Фильтре, а оставшуцся целлюлозупромывают двумя порциями воды по20 мл. Водные вытяжки объединяют.исушат, Выход фермента 804 или 40 млпрепарата с удельной активностью2500 ед/г. Технико-экономическая эффективность изобретения заключается в том, что способ позволяет лолучить препа" раты целлюлазы с содержанием фермента 1000-10000 ед/г, обладающие высокой активностью по отношению к раст" воримым и нерастворимым формам целлюлозы. Получение препарата не тре" бует значительных затрат так как позволяет многократно использовать сор-. бент, а в качестве сорбента использовать отходы хлопковой, целлюлознобумажной, вискозной промышленности. Для смывания Фермента пригодна обыч" ная вода. В ходе выделения целлюлазы происходит отделение балластных белков, пигмента, компонентов среды.культивирования, а также концентрирование в 2-5 раз и обессоливание. Это позволяет исключить процедуры концентрирования разбавленных растворов целлюлазы, культуральных жидкостей иформула изобретения Составитель О. Скородумова Редактор Н. Бгорова Техред А.Бабинец Корректор А. Гриценкотт е тЗаказ 8936/43 Тиран 505 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, И, Раушская наб., д, 4/5 Филиал ППП "Патентф, г, Ужгород, ул. Проектная, 4 7 9757 экстрактов при выделении из них фермента, а также их обессоливание.. Способ выделения целлюлазы из содержащего ее раствора, предусматривающий адсорбцию фермента на целлюлсзе при рН 3-6, о т л и ч а и - 1 Е щ и й с я тем, что, с целью повышения активности фермента, адсорбированный фермент элюируют водой или буферным солевым раствором с рН 4,5- 7,5 и ионной силой 0,0001-0,01 М с И последующей сушкой полученного элюа" та.2. Способ по и. 1, о т л и ч а ю " щ и й с я тем, что используют культуральную жидкость продуцента цел люлазы или экстракт поверхностной 96 8Мультуры, или раствор техническогопрепарата целлюлазы.3. Способ по пп. 1 и 2, о т л ич а ю щ и й с я тем, что в качествеадсорбеита используют хлопковый линтили некондиционный хлопок.4. Способ по пп, 1-3, о т л ич а ю щ и й с я тем, что перед элюцией фермента с целлюлозы осуществляют отмывку адсорбированных примесейбуферным раствором с рН 35-4,5 иионной силой 0,01-2 М.5. Способ по пп. 1-4, о т л ич а ю щ и й с я тем, что процессведут при 1-25 фС.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Авторское свидетельство СССРИ 495347, кл. С 12 0 13/10, 1973.2. Авторское свидетельство СССРй 590957, кл. С 12 й 9/42, 1975,