Способ выделения ферментов из растворов

111495347 Саоз Советских Социалистических РеспубликОП ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН ИЯ ТОР СКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУявки ЛЪ присосдицспием Гасударственный комитет Совета Министров СССР по делам изобретений И 07 КРЫТИОДата опубликования описания 01 72) Автор изобретен К. А. Калунянц,М. С. Ваганова, Г. В, Ш Т. В, Чугунова и Л. И. Стрельникова Всесоюзный научно-исследовательский ин биосинтеза белковых веществ(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕ Изобретение относится к ферментной промышленности, а имсцно к способам выделенияферментпых препаратов микробного происхождения и может быть использовано для получения очищенных препаратов, например протеазы, целлюлазы, амилазы и др.Известен способ выделения ферментов израстворов, например из фильтрата кульгуральной жидкости, предусматривающий концентрирование растворов, например, вакуум- товыпариванием, добавлснис в копцсптрат солей,например сульфата аммония, и отдсленис образовавшегося осадка. По пзвсстному способувыход фермента сравнительно низкий, не превышающий 70%, 15С целью повышения выхода ферментов исокращения расхода осаждающих рсагенговпредлагают после добавления солей вводить всмесь флотагент, декантировать, удалять жидкую фазу и добавлять органическиц растворитель, предварительно охлажденный ц имсющипзначение рН, равное изоэлектричсской точкевыделяемого фермента.Целесообразно в качсствс флотагепта использовать жидкис парафины, которые вводят 25в количество О, - 1% от объема смеси, а органический растворитель вводят в количестве1 - 2 об. ца 1 об. смеси,Целесообразно также псрсд добавлениемфлотагента смесь охлаждать и рН устанавли РМЕНТОВ ИЗ РАСТВОРОВ Вать РаВПЫМ ИЗОЭЛСКТРЦЧССаой тоа 11 ас ВЫДСЛ 11 С- мого срсрмсцтаПо предлагаемому способу получсш 1 с о 1 цщенцых ферментов осуществля 1 от двумя путями.1 способ. Мпкробцый продуцент выращивают на питательной среде, содержащей псто- шаки углерода, азота, витамины, стимуляторы роста н минеральные соли. По окончании процесса ферментации биомассу отделяют, а фильтрат концентрируют в вакууме до содержания сухих веществ 25 - 30%;, Затем в концентрат добавляют в качсствс улучшитслсй структуры осадка мипсральцые соли СаС 1. ц КаС в количествах соответственно 0,2 и 2,0 вес, % . После растворения солей концсптрат культуральной жидкости охлаждают до 1 - 3 С, доводят рН в цем до 5,0 - 8,0 путем добавления кислоты или щелочи, Органический раствор итель (этиловый, изопропиловый спирт) охлаждают до температуры от 0 до - 1 С, доводят рН в нем до 5,0 - 8,0 ц смешивают с концентратом культуральной жидкости в соотношении 3:1, Далее ферментный осадок отделяют одним из известных способов и высу.шивают.11 способ. Микробный продуцент выращивают на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, витамины, стимуляторы роста, минеральные соли, По окончании процссса фермецтации биомассу отделяют, афильтрат концентрируют в вакууме до содержания сухихвещест)в 30 - 35%, затем в концентрат добавляют сульфат аммония в ко,чичестве 40 - 50%. Смесь перемешиваот, охлак- Бдают до 7 - 9 С и регулируют рН смеси в пределах 5,0 - 8,5. Затем добавляот флотагецт(кидкие парафины) в количестве 0,1% к ооьему. Осадок фермента флотирует в течение3 - 6 ч, а затем маточный раствор сульфата Оа ммоция в количестве 0,8 - 0,9 об. сливают.Оста)вшиСя флотироваццый осадок перемешивают, к нему добавчяют 1,5 - 2 об. органического растворителя (этилового, изопропилоного спирта или ацетона) и отделяют осадок 6сепарировацием; флотагецт удаляется цз фермеитцого осадка вместе с органическим растворителем. Сырой фермецтцый осадок высушивают одним из известных способов.Маточный раствор сульфата аммония утилизпруют.П р и м е р 1, Получение очищенного препарата нейтральной протсазы,Коцтроль.Продуцспт Вас. ЯИ 1)111 Я-п)езеп 1 ег)с выращивают па жидкой питательной срелс слслующсго состава, %:Картофсльцый крахмал 8Кукурузный экстракт 0,8Магний серцокислый О,Дрожжи пивпыс 0,4Кальций хлористый 0,1Двузямсщсцпый фос 1)ят яммоии 1 0,9Вода ло 1 лКультивирование проводят при 37 С, посто- ,5янном псрсмешивации и аэрации в тсчсrис48 ч. По окопчаши фсрмецтации ца каждыйкубометр культуральцой жидкости добавляют6 л аммцачпои воды 25%,-цой коццецтряции,30 кг фильтропсрлита и 10 кг хлористого каль- Оция. Смесь тщательно перемешивают и скоягулироваппую биомассу отделяют па фильтрпрсссс. Получают фильтрат культуральиоипротсолит 1 Секо ативпос.и60 сд./мл (метод Лсйляп-Фольгарда). Для выделения препарата фермента к 1 ма фильтратакхльтуряльной жидкости (солеркацис сухихпществ 5%) при +1 С и постоянном цсрсмсшпваиии добагляют 3 мз этилового спиртакрепостью 96, охлажденного до +5 С и рН 6)0полученной смеси 6,0. Смесь выдсржшаот1 О миц и цсптрифугируют, осадок высуишвают. При таком способе выделения выход фсрмсцтя составляет 60%, по отцовешю к я Тивности культуральиой жидкости.5Расчет вь)хола фермсцтцого препарата смз культуряльпой кидкости и расхода этилового спирта ца 1 кг препарата..Активность 1 мз культуряльцой килкостп.А=60 О" ед. ПС.АктивОсть готового продукта П=-600 сл/г.Выход препарата К=0,6. Тогда весовой вых)ч препарата В составит:Д Е 60 10" 0.6= 1:;00.10 60 кг. При этом расход этацола ца осаждецие 1 кг препарата составит:300 л:60=50 л.П р и м с р 2. Получение очищенного прспарата нейтральной протеазы по предлагаемому способу.Пройудецт Вас. ЯИ 1)1 ШЯ-пчезеп 1 ег)сиз выращивают ца жидкой питательной среде следу 10- щего состава, %:Карто 1)СлыЫи крахмал 8 Кукурузный экстракт 0,8 Магний серцокислый О, Дрожжи иивцыс 0,4 Кальций хлорцстый 0,1 Двузамещеццый фосфат аммония 0,9 Вода до 1 лКультивирование проводят при 37 С, постоянном псремсшпвапии и аэрации в течение 48 ч.По окончании ферм ситации ца каждый 1 м культуралыюй кидкости дооавляют 6 л аммиачной воды 25%-цой коццситрации, 30 кг фильтроперлита и 10 кг хлористого кальция, Смесь тщательно перемешивают и скоагулироваппую биомасс) отделяют ца фильтр-прессе, Получают фильтрат культуральпой жидкости с ротсол 1 ТисскОЙ Яктивпостыо 60 ед/хл (метод ,"1 сйлп 1-Фольгарда), которь 1 й используют для получеция препарата нейтральной протеазы.1 м фильтрата культуральцой жидкости с содержанием сухих веществ 5% коицецтрируот в вакууме при 28 - 30 С в 2 раза, при этом концентрация сухих вс 1 цсств в концентрате достигаст 10%, а об)ъсм фильтрата уменьшается до 500 л. К 500 л концентрата добавляют 1 кг СяС 1, и 10 кг хлористого натрия, после растворения со.чей концентрат охлаждают до +1 С. Для обеспсчешя более олиого осаждения ферментов этиловый спирт юд 1 цсла швают 25%-пым аммиаком до рН=7,5, затем его охлаждают до температуры +5 С. К 500 л охлякдсицого коцсптрята ири иостояпцом гСрс.;ешпгапии добавляют 1500 л охлакдсицого щелочного спирта, смесь выдерживают 10 миц и цсцтрифугируют, осадок высушивают.При таком способе выделеция выход фсрмсцта составляет 80% ио отцошсишо к актив- И)сти культуряльнои жидкости.Расчет выхода 1)срмситцого препарата с 1 мэ культуряльцой жидкости и расхода этилового спирта ца 1 кг препарата,Лктвцост 1. 1 культурял).пои жид:,Ости Л=60 10" ел, ПС..Активность готового продукта П=600 ел(г.Выход препарата К= - 0,80, тогда весовой выхо;1, црсирят В составит:Л К 6 О.О.0.ЯВ:= .П ,0 0- О; - ==80 ес.что ца 30% выли. чем в коитролс. При этом расход этяцоля ця Осякдсиис 1 кг е 1 рс 1 Ярата составит: 1500:80: 20 л, что в 2,5 раза меиь- ПС. ЧСМ В КОИТР)ЛС.П рп м ср 3, Получение очищенного препарата нейтральной протсазы. Контроль.Продуцси Вяс, 1)111 эпессп 1 сгсв гыря45 50 5) 506,щиьают ца жидкой питатсльцой средс следующего состава, /ОКартофельцый крахмал 8Кукурузный экстракт 0,8Магний серцокислый О,Дрожжи пивные 0,4Кальций хлористый 0,1Двузамещеццый фосфат аммония 0,9Вода до 1 лКультивирование проволят при 37 С, постоянном персмсшивапии и аэрации в течсцис48 ). По Окопяиц) фермсцтации па саждыйкубометр культуральцой жидкости добавляют6 л аммпачноц годы 25%-)ой концентрации,30 кг фильтроперлпта и 10 кг хлористого кальция, Смесь тщательно перемешивают и скоагулировапную биомассу отделяют ца фильтр-прессе. Получают фильтрат культуральцой жидкости с протсолитичсской активностью 60 сд/мл(метод Лсйлян-Фольгарда). Для выделенияпрепарата фермента к 1 мз фильтрата культуральной жидкости (содержание сухих веществ 50/,) при +15 С и постояциом псрсмсшивацип добавляют 500 кг сульфата аммоция.После растворения соли смесь оставляот в покос ня 6 ч. Затем выпавший осадок отделяютфильтровацисм и высушивают. При таком спосоос выделения выход фермента составляет нсболее 00/О по отношспио к активности ультур(льцой жидкости,1 асчст Выхода фсрмсцтного препарата с 1 мультурдльцой жидкости и расхода су;(ьфатааммония па 1 кг препарата,ЛктивпостьМа ку;и туральной жидкостиА 60,10 в ед Г 1 САктивность готового продукта П=-600 сд/г.Выхс)д препарата К=0,7. 1 огда Вссогой Выход нрснярдта В составит;) == ---- - - , =-О ;.1 ооо оПр эОм рлс:Од см,)(та дм)оци 51 1 д ИО,чсцпс 1 кг препарат составит;505:70=7,1 кг,П р и м с р 4, Получсщ(с очищенного црслрата псйтряльцой нротсязы по предлагаемомус особу.Г 1 ролунспт Бас. Вп)1 В-п)сэепСгсп выраИпадО) нл жилкой питательной среде следуюпсп) составл, %:Картофельный крахмал 8,0Кукурузный экстракт 0,8Магний серцокислый 0,11 роясжи пиццис О 1Кл.п,ций хлористый 0,1)18 чПо 0 Оцчдпи фсрмсптлцип цл яжлый 1 мк).)И)ту)я.110 жп.кости лобдвгяот 6) л яидчпоц Вол ы 250/О-пой сицс птрацпн, 30 кг(Ьцп тросс рл(т) ц 10 г .(лорпстого кальция.Смесь тп(:.тс 1)цо псрсмешцВяот и скоаг);и)Рвд )10 б 0)дсс" О слс яюИл фп,ьр.прсссс. 5 10 15 20 25 50 ,"5 о Получают фильтрат культуральиой жидкости с протсолитической активцостью 60 сд/мл (метод Ле(.5 ц-фольга рда), который пспользуот для нолучсшя препарата псйтральпой протсазы.1 ма фильтрата сультуралшо жидкости с содержанием сухих веществ 5%, коцентрируют в вакууме при 28 - 30 С, доводя содержание сухих гецсств в концентрате до 30 - 350/О, а объем до 150 в 2 л. Затем к 200 л концентрата добавляют при постоянном персмешивании 80 кг сульфата аммония. Смесь охла)кддют до 8 - -10 С и для лучпего выпадения фермента В осадок рН смеси аммиачной водой доводят до значения 8,0 - 8,5, Затем добавляют 200 мл жидких пярафицов и осадок флотпруют в течение 6 ч. По окоцчацип флотацпи освствлспцый маточный раствор сульфата аммония в ко. личестве 180 - 200 л (9/10 об.) сливают, Ферментцый осадок суспендируют г, оставсцихс 5 20 л и смешивают с 30 - 40 л этилового или изопропилового спирта. Полученную смесь сспарируют, при этом флотагецт удаляется из фсрмснтцого осадка вместе со спиртом. От. деленный фермсцтцый осадок высушиваот.При таком способе выделения Вьход фермента составляет 900/по отцошсчппо к активности культуральцой )кидкости.Расчет выхода фермсптного препарата с 1 м" культуральцой жидкости и расхода сульс)атя яхМоция пя 1 кг препарата.Лктцвцость 1 мз культу)дгп)по жидкости Л=60 10" ел. Г 1 С,Лктпвпость готового продукта П=600 сл/г.Выход препарата К=0,9Тогя весовой выход препарата В сост- вит;х к )о о о(з(. -г -(оо 0) =90 "то пя 28 / Вьпс Оцтрол 5.Прп этом расход сульфата дммоцця ид получениег готового продукта составит:80:90=0,9 кг,что В 8 р 53 мсц И(. чсм В Оптролс. П р и м с р 5. ГОгучецпс очищенного препарат цсллюлязы (контроль).Продуцент цслгиолазы Тпс 1)осепнд цпс 1 еВыранивают на питательной среде слслующс;госоставл, /О:Свекловичный жомСль(1)ат аммонияОдпозл;ецспць (1)ос(1)орпоцслый калий 0,2КультиВпрОВяцис проводят прп пост(ппо.;псрсмсшивании и аэряпии в течение 6 сутопрп тем(сратурс 28 в -30 С. По ооцчании ультиВИ 1)овлни 5 био)(сс Отлеляот фльтрацпс,д фпльтрлт смешивают с 50% сульфата дммоия, После растворения соли выдегпп)шшйсяфермепт отделяют фильтрацией и В.л шиваотВ Вауумс.По ддцному способу Выход препарата со-.ставляет 420/О к исходной активности культурдльпой жидкости,Расчет выходя фсрмсптцого прсидрдта с 1 ма495347 Предмет изоорстспия Составитель Г. Шусь Редактср Н, Новожилова Тсхрсд Т, КурилкоКорректор Р. Юсипова Заказ 200 Изд,1073 Тираж 529 Подписное ЦНИИПИ Государствен:ого комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, М 1-35, Раушская наб., д. 45Обл. тип. Костромского управления издательств, полиграфии н книжной торговли культуральной жидкости и расхода сульфата аммония на 1 кг препарата.Активность 1 мз культуральной жидкости А=110 ед. С.Актнвйость готового продукта П = 120 сд./г,С.Выход препарата х=0,42.Тогда весовой выход препарата составит:А К 1 100,4213 1 1 вО103 --- 15При этом расход сульс 1)ата аммония на ш)лучсннс 1 кг препарата составит:500:3,5=143 кг.П р и м с р 6, Иолучспис очищенного препарата цсллюлазы по предлагаемому способу,Продуцент целлюлазы Тг 1 с 1)ос 1 егп)а шпс 1 с выращивают на питательной срсдс слсдующсго состава; вггв .Свскловнчпый жом 5Сульфат аммония 1Однозамсщснный фосфорно кислый калин 0,21(ультпвирование проводят,нрн псстояпном персмешивании и аэрации в течение 6 суток и темпсратурс 28 - 30 С, По окончании культивирования биомассу отделяют фильтрацией. 25 Фильтрат концентрируют в вакууме при температуре 28 - 30 С до содержания сухих веществ 20%. При этом объем 1 м )ильтрата уменьшается в 8 - 10 раз, т. с, копсчный объем концентрата составляет 100 л, Затем к 100 л кон цептрата прибавляют при постоянном псрсмсшивапии 50 кг сульфата аммония н 100 л жидких парафинов; осадок флотируют в течение 4 ч. По окончании флотации 90 л осветленного маточного раствора сливают, фсрмснтный оса док суспендируют в оставшихся 10 л маточного раствора, смешивают с 20 л этплового нли изопропилового спирта. Полученную смесь сспарируют, при этом флотагснт удалястся из ферментного осадка вместе со спиртом. Отделен ный ферментный осадок высушивают, Выход фермента при таком способе выделения составит 85%.Расчет выхода фсрментного препарата с 1 м культуральной жидкости и расхода сульфата 45 аммония на 1 кг препарата.Активность 1 м культуральной жидкости А=1,0 1 Ов ед. С. Активность готового продукта П =120 ед/г. С.Выход прспарата К=0,85.Тогда весовой выход препарата составит:ЛК 1010 0,75П 120 10Прн этом расход сульфата аммония на получение 1 кг препарата составит:50:7,1=7,00 кг,что в - 20 раз меньше, чем в контроле,Прсдлагасмый способ позволяет повысить выход фсрмснтного препарата до 80 - 90%, значительно увсличить степень сто очистки и снизить расход этилового спирта на оса)кдсние от 3 до 10 раз, расход сульфата аммония от 8 до 20 раз,1. Способ выделения ферментов из растворов, например из фильтрата культуральной жидкости, предусматривающий копцснтрированис растворов, например вакуум-выпариваштсм, добавление в концентрат солей, например сульфата аммония, и отделение образовавшегося осадка, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода Ч)ермснтов и сокращения расхода осаждающих рсагснтов, после добавления солей в смесь вводят флотагент, декантируют, удаляют жидку)о фазу и добавляют органический растворитсль, предварительно охла)кдспный и имеющий значснис рН, равное изоэлсктричссеой точке выделяемого Ч)срмента.2. Способ по и. 1, отгичающийся тем, что в качестве флотагснта используют )кидкие парафины.3. Спосоо по и, и, 1 - 2, отличающийся тем, что )кидкис парафины вводят в количестве 0,1 - 1% от объема смеси,4. Способ по и. п. 1 - 3, отличающийся тем, что органический растворитсль вводят в количестве 1 - 2 об. па 1 об. смеси,5, Способ по и, п, 1 - 4 отличающийся тем, что псред добавлением флотагснта смесь охлаждают и рН устанавливают равным изоэлсктричсской точкс выделяемого фермента.