Способ получения l-треонина

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИН 09) (1) 1) С 12 Р 13 Зла САНИ ЕТЕН ЙИ 6 Ь: ЧЬЯ 1 ВУ видетельство ССС 12 0 13/06, 1980(56) Авторское В 904325, кл,ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГННТ СССР Н АВТОРСКОМУ СВИ(54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ Ь-ТРЕОНИНА предусматривающий приготовление лосе ного материала путем выращивания про Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способу получения незаменимой аминокислоты - Ь-треонина, применяемой в качестве компонента различных пита- тельных смесей медицинского назначе" ния, добавки в пищу человека и в корм животных, а также как реактив для фармацевтической и химической промышленности и как ростовой фактор для микроорганизмов, продуцирующих другие аминокислоты, например Ь-лизин, Ь-гомосернн. дуцирующих его микроорганизмов видаЕзсЬегсЬа со 1 д в жидкой среде вприсутствии гидролизата или автолизата белоксодержащего субстрата .и пенициллина, введение посевного материалав ферментативную среду, содержащуюисточники углерода, азота и минеральные соли, ферментацию в глубинныхусловиях с последующей обработкойкультуральной жидкости и выделениемцелевого продукта, о т л и ч а ю -щ и й с я тем, что, с целью повыше ния выхода треонина, снижения продолжительности ферментации при одновременном уменьшении расхода сырья, приприготовлении посевного материала извида ЕзсЬег 1 сЬ 1 а со 1 используютштамм ЕзсЬегхсМа со 11 ВНИИ генетика472 Т, выращивание которого осуществляют при рН 6,5-7,5 путем дробного введения в посевную среду аммиачной воды. Известен способ получения Ь-треонина с использованием штамма ЕзсЬет 1 сЬа соИ ВНИИгенетика 472 Т, споеобного усваивать сахароэу и. устойчивого к треонину и гомосерину. Способ предусматривает при культивировании плазмидного продуцента выращивание посевного материала на жидкой посевной среде с последующим введением посевного материала в ферментационную среду, На стадии выращивания посевного материала в посевную среду вносят источники углерода, азота, минераль 974817ные соли, мел, а также гидролизатбелоксодержащих субстратов и пенициллин.После глубинной ферментации культуральную жидкость обрабатывают н выде 5ляют целевой продукт.В известном способе при культивировании плазмидного продуцента треонина значение рН к концу выращиванияпосевного материала снижается до 5,0-5,5При внесении посевного материалас низким значением рН в ферментационную среду, которая имеет нейтральноезначение рН, происходит задержка начала развитиякультуры на несколькочасов, связанная с адаптацией культуры к новым условиям культивирования,что приводит к увеличению продолжительности ферментации. Максимальноенакопление Ь-треонина (до 32 г/л)достигается за 55 ч ферментации. Приэтом на синтез 1 г аминокислоты расходуется 4 г углеводовНедостатками указанного метода 25получения Ь-треонина являются недостаточно высокий уровень накопленияЬ-треонина и большая продолжитель-,ность ферментации,Целью предлагаемого изобретенияявляется повышение уровня накоплениятреонина в кудьтуральной жидкостии сокращение продолжительности ферментации при одновременном уменьшении Расхоца углеводов на синтез аминокислоты.Поставленная цель достигается тем,что в способе получения Ь-треонина,предусматривающем приготовление посевного материала путем выращиванияпродуцирующих его микроорганизмоввида ЕвсЬег 1 сЬда со 1 в жидкой средев присутствии гидролизата или автолиэата белоксодержащего субстрата ипенициллина, введение посевного материала в ферментационную среду, содержащую источники углерода, азота иминеральные соли, ферментацию в глубинных условиях с последующей обработкой культуральной жидкости и выде- .лением целевого продукта, предложеносогласно изобретению прн приготовлении посевного материала из видаЕзсЬегасЬда со 1 д использовать штаммЕвсЬегхсМа со 11 ВНИИгенетика 472Т, выращивание которого осуществ 55ляют при рН 65-7,5 путем дробноговведения в посевную среду аммиачнойводы. Способ позволяет получить до 55 г/л Ь-треонина за 40 ч ферментации при минимальном расходе углеводов до 2,5 2,5 г на 1 г треонина.Штамм Е.со 1 ВНИИгенетика 472 Тдепонирован в Центральном музее промышленных микроорганизмов и имеет регистрационный номер ЦМПМ В. Штамм" Е.со 1 д ВНИИгенетика 472 Ти штаммпрототип Е.со 1 ВНИИгенетика 472 Т имеют общего предшественника - штамм Е.со 11 ВНИИгенетика 472, который получен введением детерминантов и сбраживания сахарозы в клетки штамма Е.со 11 ВНИИгенетика М, и являются мутантами этого штамма, устойчивыми к треонину и гомосерину при их содержании в среде более 0,5 г/л. Штамм Е,со 11 ВНИИгенетика 472 Тотличается от штамма Е.со 1 ВНИИгенетика 472 Т стабильным сохранением признака устойчивости к укаэанным аминокислотам,и более стабильным сохранением плазмиды в процессе культивирования на обогащенных питательных средах, а также более высокой удельной продуктивностью (см. табл.1).Штамм Е.со 11 ВНИИгенетика 472 Тимеет следующую культурально-морфологическую характеристику.Морфология. Грамотрицательные слабоподвижные тонкие палочки с закругленными концами размером 1,5-2 мкм в длину.Культурально-физиологические признаки. Мясо-пептонный агар. Через 24 чороста при 37 С обраэует круглые беловатые полупрозрачные колонии диаметром 1,5-3 мм, поверхность колонии гладкая,. края ровные или слегка волнистые, центр колонии слегка припод" нят, структура однородная, консистенция пастообразная, легко эмульгиру ются. Рост на агаризованной минимальной среде Адамса. Через 40-48 ч роста прн 37 С образует колонии 0,5-1,5 мм в диаметре, серовато-белые, полупрозрачные слегка с блестящей поверхностью, ослизняющиеся через 4-5 суток.Рост в мясо-пептонном бульоне. После 24 ч роста при 37 С наблюдается сильное, равномерное помутнение, небольшой осадок, запаххарактерный.Рост в жидкой минимальной среде Адамса. Через двое суток роста с аэрацией при 37 ОС наблюдается сильноемере необходимости. На 27 часу ферментации концентрация треонииа в культуральной жидкости достигает 48 г/л,на 40 часу - 55 г/л. Расход сахарана 1 г треонина на конец Ферментациисоставляет 2,5 г.Для выделения треонина 400 мл культуральной жидкости нагревают в течение 5 мин до температуры 100 фС, затем 10биомассу отделяют центрифугированием.Полученный нативны 9 раствор упариваютпод вакуумом до 80 мл, добавляют кнему 20 мл этанола и кристаллизуюто7 ч при температуре 0 С. КристаллыФильтруют и сушат, Получают 15,4 гЬ-треонина.П р и м е р 2. Продуцент треонинаи условия выращивания посевного материала те же, что и в примере 1, Отличие состоит в том, что значение РНв ходе выращивания посевного материала поддерживают иа уровне. 6,5. Через24 ч культивирования посевной. материал с титром клеток 1 10 (доля кле1 Оток, утративших плаэмиду, не более6 Х) в количестве 103 вносят в ферментационную среду следующего состава,Х;Глюкоза 2.Аммоний сернокислый 0,5 30Калий фосфорнокисзыйоднозамещенный 0,1ферментацию ведут в тех же условиях, что и в примере 1, с тем отличием, что в качестве РН-статирующего 35агента используют питательную добавку, состоящую из смеси 40 раствораглюкозы и 253 водного раствора аммиака в соотношении 6: 1 (по объемам).Через 40 ч ферментации накопление щ 0треонина составляет 41 г/л, Расходглюкозы на 1 г синтезированного треонина составляет 3.,1 г,Дпя выделения Ь-треонина 400 млкультуральной жидкости нагревают втечение 20 мин до 60 С, затем биомасосу отделяют центрифугированием. Полученный нативный раствор пропускаютчерез колонку со смолой КУ-8 в Нформе. Сорбированный треонин элюируют37-ным раствором аммиака, упариваютдо содержания сухих веществ 803, добавляют этанол в количестве 1/3 отобъема упаренного алюата и кристаллизуют в течение 12 ч при темпеРатуре0 - (+5) С, Кристаллы Ь-треонина отфильтровывают, промывают и,сушат.Получают 15 г Ь-треонина (выход сос 3 тавляет 92 Х). Анализ чистоты продукта методом тонкослойной хроматографии (10 мкг) показывает отсутствие других аминокислот.П р и м е р 3. Продуцент треонина и условия выращивания посевного материала те же, что и в примере 1, Отличие состоит в том, что в качестве питательной добавки в посевную среду вместо автолизата дрожжей вносят гидролизат БВК в количестве О, 1 Х (в расчете на исходный БВК). Посевной материал выращивают в условиях РН- статирования при РН 7,5 + 0,1 в течение 24 ч. Титр клеток в готовом посевном материале 0,9 10 кл/мл (доля,оклеток, утративших плазмиду, не более 8 М . Посевной материал в количестве 107 используют для засева ферментационной среды следующего состава, Х:Сахароза 8Аммоний сернокислый 0,5 Калий фосфорнокислыйоднозамещенный 0,1 ферментацию ведут в тех же условиях, что и в примере 1. Через 13 ч культивирования, когда концентрация углевода в среде снижается до, 53в ферментационную среду вносят дополнительно еще 4 сахарозы. К 30 часам ферментации сахар утилизуется полностью и накопление треонина составляет 39 г/п. На синтез 1 г треонина расходуется 3,0 г сахарозы.Для выделения Ь-треонина культуральную жидкость обрабатывают также, как в примере 1, Полученный нативный раствор упаривают до содержания сухих веществ 307 и кристаллизуют при охлаждении (+3-5 С). Получают технический препарат Ь-треоннна с содержанием основного вещества 907 Выход продукта составляет 75 Х.Таким образом, предлагаемый способ позволяет снизить продолжительность ферментации до 30-40 ч по сравнению с 30-55 ч по известному способу. При этом выход составляет 39-55 г/л Ь- треоиина (в известном способе максимальный выход, до"тигаемый за 55 ч ферментации, составляет 32 г/л). Минимальный расход углеводов на синтез 1 г Ь-треонина составляет 2,5 г, что на 407. ниже, чем в известном, в котором на синтез 1 г аминокислоты расходуется 4 г углеводов.97481 равномерное помутнение, запах харак-терный.Рост по уКолу в мясо-пептонном агаре. Хороший рост о всему уколу.Рост на желатине. Желатину не разжижает.Рост на молоке. Хороший рост с коагуляцией молока.Образование индола. Индол обра Озует,Рост на различных углеводах. Хорошо растет на сахарозе, глюкозе, лактозе, маннозе, галактозе, ксилозе,фруктозе, глицероле, маинитоле с образованием кислоты и газа,Отношение к антибиотикам. Устойчивк пенициллину.Патогенность. Не патогенен,Содержание плаэмид, Клетки содержат многокопийную нлазмиду рУМ(мол,вес 5.8 мегадальтон), обеспечивающую устойчивость бактерий к пенициллину и несущую гены треониновогооперона. 25Способ осуществляют следующим образом.Клетки продуцента Е,со 1 д ВНИИгене-,тика 472-Твыращивают на агаризованной минимальной питательнои среде 30в присутствии пенициллина, затем суспензией клеток, смытых со скошенногоагара, засевают жидкую питательнуюпосевную среду, содержащую источникиуглерода, азота, необходимые минеральные соли, питательную добавку ввиде гидролизатов белоксодержащнхсубстратов и пенициллин, Посевнойматериал выращивают в ферментере, оснащенном системой рН-статирования, 40при температуре 35-37 С и непрерывномаэрироваиии и перемешивании в течение20-30 ч. Значение рН в ходе выращивания посевного материала поддерживаютиа уровне 6,5-7,5 дробным введением 45в ферментер аммиачной воды, Приготовленный таким образом посевной материал используют для засева ферментациоиной среды, содержащей источникиуглерода (например сахар или глюкозу), 50источники азота и необходимые минеральные соли, Ферментацию осуществляют в ферментерах, оснащенных системойрН-статирования, при рН 6,5-7,5, температуре 35"37 С и непрерывном перемешивании и аэрировании. В качестверН-статирующего агента применяют либоаммиачную воду, либо сбаллансированную по углероду и аммиаку подпитку. 7 бПродолжительность ферментации 30"40 ч, На 40 ч культивирования в культу- ральной жидкости накапливается до 55 г/л треонинаДля выделения треонина культуральную жидкость подвергают быстрому нагреву в течение не более20 мин до температуры 60-100 С, с целью предупреждения лизиса клеток,затем биомассу отделяют центрифугиро- ванием или сепарированием. Выделениетреонина из полученного нативного раствора осуществляют одним из изве- .стных способовСпособ поясняется следующими примерами.П р и м е р 1. Культуру продуцента Е.со 1 х ВНИИгенетика 472 Т, выращенную на агаризованной минимальной среде с глюкозой в присутствии пенициллина, пересевают на жидкую посевную питательную среду следующего состава, 7:Сахар технический 4Аммоний сернокислый 0,5Калий фосфорнокислыйдвузамещенный 0,2Магний сернокислый 0,04Автолизат дрожжей 0,2Пенициллин 0,01Доза засева 110 клеток в мл.Выращивание посевного материала проводят в ферментере емкостью .0,5 л при аэрировании 05 л воздуха в минуту, перемешивании 900 об/мин,температуре 37 С. рН-статирование осуществоляют на уровне 7,00, путем автоматической подачи в ферментер аммиачной воды. Время выращивания посевного материала 20 ч. Титр клеток в готовом посевном материале 110 кл/мп (доляюклеток, утративших плазмиду, не более 6 Х)., Посевной материал в количестве ОЕ вносят в ферментационную среду следующего состава, %:Сахар технический 8Аммоний сернокислый 0,5Калий фосфорнокислыйоднозамещенкый 0,1Ферментацию проводят в ферментере с рабочим объемом 0,5 л, оборудованном системой рН-статирования. Режим ферментации: аэрирование 0,5 л/мин. перемешивание 900 об/мин, температура 37 С, рН-статирование на уровне 7,0 й +О, 1 путем подачи аммиачной воды. После исчерпания из ферментационной среды начальной порции сахара его вносят дробно в несколько порций, по974817 10 Сравнительная характеристика атаммов Е.со 1 ВНИИгенетика 472 Т и 472 ТШтамм Максимальная треонину и пеницилгомосерину, Х лину, Х 0,14 1-3 100 0,23 Редактор Е.Мисропова Техред М.Дидык Корректор Т.Малеце Заказ 3086 Тираж 490 Подписное.ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 йПроизводственно"издательский комбинат ."Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 1 О 1 ВНИИгенетика 472 ТВНИИгенети.ка 472 ТОтносительное содержание клеток, сохраняющихпосле 10 генераций набульоне Хоттингера,устойчивость,к 82-98 98-99 удельная продуктивностьг треонинаг биомассы в ч