Штамм перевиваемых клеток мсв, используемый для культивирования риккетсий и вирусов

СОЮЗ СОВЕТСКИХ ЦИАЛИСТИЧЕСН 09) СПУБЛИН(51) С 1 ГОСУД ОТМЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАЮ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ЕТЕЛЬСТВ ПЕРЕВИВАЕМЫХ КЛЕТОК МСВ,1 Й ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯВИРУСОВ.перевиваемых клеток МСВлекция перевиваемыхоночных Института вирусо.И. Ивановского АМН СССР),й для культивированиявирусов.(71) Ордена Трудового Красного Знамени институт эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н.Ф, Гамалеи(53) 576,8,093,35(088.8) (56) 1. Еаг 1 е И.К. СЬапцев 1 поцсес 1 п а Бггап оГ ГдЪгоЬ 1 авсв Ггощ а Бгга 1 п СЗН Моцве Ьу гпе Асг 1 оп оГ 20-МегЬУ 1 сЬо 1 ацгеп (рге 1 ппдпагу Керогаз), - Л. Наг Сапеег )цвг, 194332. Стромская Т.П., Ставровская А.А Кариотипические особенности и прививаемость некоторых клеточных линий млекопитающих. - "Вопросы онкологии", 1974, т. 20, У 2, 60 (прототип). У 6Изобретение относится к экспериментальной биологии и может быть использовано для генетических исследований.Известна перевиваемая линия клеток Ь, полученная из эмбрионов мышей Ь 1 1.Однако она контаминирована микоплаэмами, вирусами и клетками других иний, 10Известен также штамм перевиваемых клеток мышей Мс высокой интенсивностью размножения 1.23.Этот штамм получен путем трансформации эмбриональных фибробластов 15 мьпцей С 57 В Ь вирусом БЧ, однако он не способен пролиферировать при супраоптимальной температуре.Целью изобретения является получение нового штамма перевиваемых 20 клеток, обладающего высокой интенсивностью размножения, формирующего стабильный пласт фибропластоподобньв клеток, чувствительного к воэбу - дителям риккетсиозных инфекций и 25 вирусам, не контаминированного ми коплазмами и вирусными агентами и способного пролиферировать при супра,оптимальных температурах.Поставленная цель достигается З 0 с помощью штамма перевиваемых клеток МСВ.Штамм хранится в коллекции перевиваемых клеток позвоночных Института вирусологии им. Д.И. Ивановского подномером 446/Для получения штамма МСВ перевиваемых клеток используют эмбрионы, стерильно извлеченные из матки мышей С 57 В /6/в последние дни бере - менности. Тела эмбрионов измельчают и подвергают трипсинизации при 37 С в 0,257.-ном растворе трипсина. Суспензию клеток в концентрации 1.10 клеток в 1 мп среды 199 с 10 Ж сыво ротки крупного рогатого скота в объеме 250 мл вносят в матрацы.В первый месяц культивирования п 1 оизведены два пересева в отношен и 1:2, После второго пересева размножение клеток практически прекра - щается. В матрацах образуется рыхлая сеть, состоящая из крупньи, полиморфных клеток с длинными отростками. Жизнеспособность этих клеток поддерживают, периодически сменяя питательную среду. Через 3 мес после первичного высева эмбриональных клеток в одном из шести матрацев обнаруживаютколонию мелких, округлых плотно прилегающих друг к другу клеток. Размеры колонии постепенно увеличиваютсяза счет митотического деления клеток. Колонию снимают с поверхностистекла матраца и переносят в пробирку с 1 мл питательной среды. Клеткиэтой колонии являются началом перевиваемой линии клеток МСВ. Линияклеток МСВ поддерживается в лаборатории риккетсиозов ИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи в течение 6 лет, проведеносвыше 350 пассажей с высоким индексом пролиферации - 6.Штамм перевиваемых клеток МСВимеет следующие морфологические физиологические и кариологичЕскиехарактеристики.Культура МСВ состоит из фибробластоподобных клеток веретеновидной и полигональной формы с четкимиграницами. Ядро круглое или овальное, четко контурировано, содержит2-3 небольших ядрышка, кариоплазмазаполнена мелкозернистым хроматином.Цитоплазма клеток мелкозернистая,как правило, не вакуолизирована, безвключений.Рост клеток однослойный.При фиксации препаратов жидкостьюБуэна или смесью по Шабадашу окраска их гематоксилином и зозином несколько слабее, чем, например, перевиваемых мышинных клеток Ь.При высеве единичные клетки в процессе размножения образуют островкиполигональной формы, которые по мерероста сливаются, формируя сплошнойпласт клеток. При высеве 10 клетокв 1 мл сплошной пласт в пробиркеили флаконе (матраце) образуется на4-5-е сутки. Клетки легко отделяютсяот стекла 0,027.-ным раствором версе 1на, 0,25%-ным раствором трипсинаили механическим путем.Адгезивная активность клетокхорошая,Пересев клеток МСВ производят после образования сплошного пласта.Припересеве механическим путем из сосуда удаляют старую питательную средуи добавляют 1- 10 мп (в зависимостиот емкости сосуда для культивирования) свежей среды, в которую очищаютшпаделем клетки со стекла, Взвеськлеток доводят свежей питательнойсредой до требуемой концентрации ивысевают в новые сосуды. Пересевы с помощью версена или трипсина производят по известной методике.,Культура клеток МСВ адаптирована к питательной среде следующего соста ва. "среда 199 отечественного производства с 107 (нативной) сыворотки крупного рогатого скота без антибиотиков. Добавление антибиотиков пенициллина и стрептомицина (100 ед/мл) - не влияет на морфологию и пролиферативную активность клеток МСВ.Хранение клеток МСВ.Для поддержания жизнеспособности 5 клеток МСВ их пересевают 1 раз в 4-7 дней при разведении клеточной суспензии 1:5-1:8. В условиях термоостата при 35 С пласт клеток сохраняется в течение 10 сут без смены пита С тельной среды. При комнатной температуре 18 - 21 С клетки сохраняются в те- чение двух недель.Изучаемая культура является гетероплоидной с широкими колебаниями чис ла хромосом (20-100), При этом 9 Ж клеток содержит более 100 хромосом. Метафазные пластинки со свойственным для клеток мыши числовым набором хромосом (40) составляют 37 всей О клеточной популяции. Модальный класс равен 82-84. Модальный класс составляет около трети всей клеточной популяции. При исследовании 10 метафазных пластинок, входящих в модальный класс, видно, что большую часть хромосомного набора составляют акроцентрические хромосомы (74-80). Кроме того, присутствуют метацентрические и субметацентрические хромосомы; в 4 Е 8 из изученных клеток были обнаружены микрохромосомы.Тесты на онкогенность отрицательны, Подкожное введение клеток линии МСВ гомологичным (мыши линии С 57 В 1./6) и гетерологичным (беспородные белые мыши) мышам в дозе 3 10 клеток не вызывало образование опухолей в период двухмесячного наблюдения. 10 50Чувствительность к микроорганизмам.Перевиваемая линия клеток МСВ чувствительна к риккетсиям возбудителя эпидемического сыпного тифа35 Ис 1 сеггза ргот 4 аге 1 а) и риккет-сиозной оспы (Б а 1 агд) и к вирусам ЧЯЧ и ЕМС. Уровень накопления риккетсий определяют на пятые сутки после заражения клеток перевиваемой линии МСВ путем титрования на разви. - вающихся куриных эмбрионах (РКЭ) 6 7-дневного возраста.Риккетсии Провачека поддерживаются с сохранением инфекционности в течение многих пассажей на клетках перевиваемой линии МСВ со средним уровнем накопления 5,5 1 Д /мл.Размножение риккетснй Провачека в клетках перевиваемой линии МСВ сопровождается развитием цитопатических изменений.Культивирование риккетсий и вирусов с использованием штамма перевиваемых клеток МСВ.П р и м е р 1. Способ культивирования риккетсий Провачека, штаммъВгеж 1.В матрацную колбу с клетками линии ИСВ на уровне 150-го пассажа вводят 0,022-ный раствор версена, подогретый до 35 С. Через 1 мин версен удаляют, а сосуд с клетками помещают в термостат при 35 С на 5 мин. Отслоившиеся клетки ресуспендируют в среде роста: среда 199 с 107 сыворотки крупного рогатого скота и разливают на 4 матрацные колбы.Эти культуры 151-го пассажа инкубируютопри 37 С в течение 2.сут до момента формирования сплошного слоя.При заражении риккетсиями среду из культуральных сосудов сливают, клетки трижды промывают раствором Хэнкса и вводят суспензию риккетсий, полученную из желточного мешка РКЭ и разведенную 1:50 О. Контакт осуществляют в течениео2 ч при 35 С. Затем инокулюм удаляют, культуру трижды отмывают раствором Хенкса от неадсорбировавшихся риккетсий и добавляют среду роста и инкубируют при 35 С. Сбор риккетсий производят через 4 для после заражения и определяют титр их накопления на 6 - 7 -дневных РКЭ.Титр равен 5,5 1 оя 1 Д /мл.5 оЧасть матрацных колб с риккетсиями, выращенными на клетках перевиваемой линии МСВ, замораживает и хранят в минусором холодильнике,Храп.ние риккетсий в течение двух лет (время наблюдения) не приводит ;к снижению титра цнфекционности.1139751 Составитель И. КрасильниковТехред О.Неце Корректор А. Ильин Редактор Т. Веселова Тираж 525 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж-З 5, Раушская наб д. 4/5 Заказ 224/19 Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Риккетсии Провачека прошли более.20 пассажей на культурах клеток МСВ с сохранением титра 5,5 1 о 1 Д/мл.П р и м е р 2. Способ культиви-рования КхсЕеййза айаг, штамм МК. 5Клетки перевиваемой линии МСВ на уровне 180-го пассажа получают и заражают риккетсиями по способу, описанному в примере 1. Титр риккетсий равен .,47 1 оя 1 Д /мпП р и м е р 3. Способ культивирования вируса ЧЗЧ.Клетки линии МСВ на уровне 232-го пассажа получают по способу, описанному в примере 1. 5При заражении вирусом среду из культуральных .сосудов сливают, клетки трижды промывают раствором Хенкса и вводят 1 мп .среды, содержащий 100 доз вируса, выдерживают 1 ч при 20 37 С, затем трижды промывают раствором Хенкса для удаления неадсорбировавшегося вируса и заливают поддерживающей средой - среда 199 с 27 сыворотки крупного рогатого скота и ин кубируют при 37 С. Сбор вируса производят через 24 ч после заражения (полная дегенерация клеточного пласта) и определяют титр вируса по раз - витию цитопатического эффекта, 30Титр равен 10 ТЦЦ р/мл.При культивированием вируса на перевиваемой линии клеток его титрРавен ТЦЦ 5(млП р и м е р 4. Способ культивирования вируса ЕМС.Клетки линии МСВ на уровне 235-го пассажа получают по способу, описанному в примере 1, а заражение вирусом и инкубирование производят по щ способу, описанному в примере 3.Сбор вируса производят через 48 ч после заражения (полная дегенерация клеточного пласта). Титрравен 10 ТЦЦ 5/мл.45 При культивировании вируса ЕМС на перевиваемой линии клеток его титр равен 10 ТЦЦ /мп.П р и м е р 5. Клетки линии МСВ высевают в матрацы со средой 199 и 10 Е сыворотки в дозе 10 в 1 мл и через Эсут культивирования их снимают со стекла трипсином, версеном или механическим путем и полученную, суспензию подсчитывают в камере Горяева или Фукса - Розенталя. Клетки, выращенные на разныхсериях среды 199 отечественного производства дают накопление от 5 10до 10 клеток в 1 мл, т.е. увеличение исходного количества происходитв 5-10 раз.Перевиваемая линия клеток МСВ вотличие от аналога и прототипа обладает способностью интенсивной про-лиферации при культивировании присупраоптимальной температуре 40 Сс сохранением высокого накопленияклеток, сравнимого с накоплениемпри оптимальных температурах 35 -36 С,Способность перевиваемой линииклеток МСВ при 40 С позволяет применять ее в генетических исследованиях, в частности для выделения иизучения температурочувствительных(1 з) мутантов риккетсий и вирусов.Кроме того, перевиваемая линия кле-ток МСВ отличается, высокой пролиферативной активностью, легкостью субкультивирования, не требует особыхвидов питательных сред и дефицитнойэмбриональной сыворотки телят, возможностью культивирования как в присутствии антибиотиков, так и без них,обладает устойчивыми морфологическими,.биологическими и уникальными от других перевиваемых линий мышей генетическими особенностями.