Способ культивирования вирусов

О П И С"А Е ИЗОБРЕТЕНИЯ Союз СоветсинкСоциалистическихРеслублнк р 1764391 К АВТОРСКОМУ СВИ ЕТ 1 ЛЬСТВУ(22) Заявлено ЗМХ 79 (21) 2723822/28-13 Р 1)М, Кл,3 С 12 й 7/00 с присоединением заявки йо Государствеииый комитет СССР ио делам изобретеиий и открытий(72) Авторы изобретения Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР(54.) СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВИРУСОВ Изобретение относится к областимедицины, а именно вирусологии, и может найти применение для культивирования вакцинных штаммов вируса.Известен способ культивированиявирусов путем размножения на линиидиплоидных клеток 11).Однако этот способ является малодоступным, кроме того, линииклетоквысоко чувствительны к определеннымпитательным средам и сывороткам,Цель изобретения - упрощение способа,Это достигается тем, что вирусыразмножают на линии диплоидных клетоккожи и мышц эмбриона человека М,Полученная линия диплоидных клеток кожи и мышц эмбриона человека М имеет следующие биологические, генетические и морфологические характе - ристики.Культура состоит из фибробластоподобных клеток, Морфология клеток остается стабильной в течение фазы активного роста,,Клетки легко снимаются со стеклараствором трипсина, при субкультировании быстро прикрепляются к стеклуи на 3-4 сутки образуют монослой.Клетки хорошо растут на среде Игла ги среде МЕМ с 10 сыворотки крупногорогатого скота, - коэффициент развивкисоставляет 1:2, 1: 3.Клетки имеют ограниченное времяжизни вне организма, до 66 пассажа,на протяжении фазы активного ростане теряют своих генетических свойств,При кариологическом анализе установлено, что модальный класс на уровнедесятого, двадцатого, тридцатого исорокового пассажей составляли клетки с двойным набором хромосом (2 п),Число диплоидных клеток на протяженииФазы активного роста колебалось от 15 97 на ранних пассажах до 85,6 напоздних, гипоплоидных - 1,6-2,0,гиперплоидных - 1,0-12, 8. Обследовано 1200 метафаз. Установлено, чтокариотип диплоидных клеток не отли чается от кариотипа, характерногодля мужского пола. При сравнениихромосомных наборов на разных уровнях пассажей различий не обнаружено,что свидетельствует об отсутствииконтаминации линии другиМи клетками.Различий также не выявлено в рисункедифференцированности хромосом по длине при окраске по Гимза, что такжеуказывает на генетическую стабильность 30 культуры.Клетки линии Мне контаминированы бактериями, грибами и микоплазмами,Посторонние вирусы не выявлены ни вкультурной жидкости, ни в клетках.Тесты на онкогенность также были отрйцательными.По мере размножения клетки заморакивали на различных "уровнях пассажейдля хранения в жидком азоте, таким образом создан Их банк. При восстановлении клетки сохраняли жизнеспособность. она 70-80 ,Клетки линии чувствительны к различным вирусам группы ЕСНО, Коксаки,полиомиелита и клещевого энцефалита.В частности, характер цитопатическихизменений под действием вируса полиомиелита штаммов Сэбина по морфологиии срокам развития не отличается отнаблюдаемого в первичной культуреклеток почек обезьян, используемыхдля изготовления вакцины против полиомиелита и клещевого энцефалита. Вчастности, характер цитопатическихизменений под действием вируса полиомиелита штаммов Сэбина по морфологиии срокам развития не отличается отнаблюдаемого в первичной культуреклеток почек обезьян, используемыхдля изготовления вакцины против полиоми ели та.Вирусклещевого энцефалита в клетках линии Мразмножается со стабильно высокими показателями титров, чегоне наблюдается при заражении первич-ных культур клеток куриного эмбриона,используемых для изготовления вакцины против клещевого энцефалита.35Приводятся примеры культивирования вирусов на линии диплоидных кле. 1 ок кожи и мышц эмбриона человека М,П р и м е р 1, Способ культивирования вируса полиомиелита, штамм Сэбина 1 типа,В матрасную колбу с диплоиднымиклетками кожи и мышц эмбриона человека Мна уровне 1 пассажа вводят0,25 %-ный раствор трипаина, подогретый до 37 ОС, Через 10 с раствор" удаляют, а сосуд с-клетками помещаютв термостат при температуре 37 дС йа2 мин. После этого в него вносят небольшое количество питательной средыи энергичным встряхиванием э аканчивают процесс отделения клеток" от бтек- ла. Затем в клеточную взвесь добавляют среду роста - среду МЕМ с 10сыворотки крупного рогатого скота,и разливают на две матрасные к, б,. 55Эти культуры 19 пассажа инкубируютпри 37 С в течение 4 суток до момента формирования плотного слоя.При заражении вирусом среду иэхультуральных сосудов сливают, клет- Щки трижды проювают раствором Эрла ивводят вируссодержащую жидкость израсчета 3 БОЕ на клетку. Затем добавляют поддерживающую среду, в качествекбторой используют среду МЕМ.Инфицированные культуры инкубируютпри 34 С. Сбор вируса. производят на4 день после заражения и определяютего титр по методу образования бляшек. Титр равен 7,7 9 БОЕ/мп.Параллельно аналогичным способоминфицируют первичную культуру клетокпочек обезьян, и вирус в ней размно 1 кается до титра 7,5 Ед БОЕ/мп,П р и м е р 2, Способ культивирования вируса полиомиелита, штамм Сэбина И типа.Клетки линии Мна уровне 19 пассажа получают и заражают вирусом поспособу, описанному в примере 1. Приэтом титр вируса как при размноженииего в данной культуре, так и в первичной культуре клеток почек обезьянсоставляет 7,5 1 д БОЕ/мл,П р и м е р 3, Способ культивирования вируса полиомиелита, штамм Сэбинатипа.Клетки линии Мна уровне 19 пассажа получают и заражают вирусомпо способу, описанному в примере 1,При этом титр вируса как при размножении его в данной культуре, так и впервичной культуре клеток почек обезьян составляет 7,5 Ъд БОЕ/мл.П р и м е р 4 . Способ культивирования вируса ЕСНО 1,Клетки линии Мполучают и готовят к заражению по способу, описанному в примере 1. При заражении вносятвируссодержащую жидкость из расчета1 БОе на клетку. Для адсорбции вируса культуры выдерживают при 37 фГ втечение 1,5 ч, после чего добавляютподдерживающую среду. Культуры инкубируют при 37 О С, сбор вируса проводятчерез 5 дней после заражения, затемопределяют его титр, который равен7,3 39 БОЕ/мл.Параллельно аналогичным способомзаражают первичную культуру клетокпочек обезьян и вирус в ней размножается до титра 6,5 29 БОЕ/мл.П р и м е р 5. Способ культивирования вируса ЕСНО 12.Клетки линии Мполучают и готоВят к заражению по описанному в примере 4 способу . При заражении вносятвируссодержащую жидкость из расчета2 БОЕ на клетку, Вирус собирают на5 день после заражения и его титр равен 7,6 д БОЕ/мл. При параллельномзаражении аналогичным способом первичных культур клеток почек обезьян титрвируса достигает лишь 5,7 д БОЕ/мл,П р и м е р б, Способ культивирования вируса Коксаки В 5.Клетки линии Мполучают и заражают по способу, укаэанному в примере5.Титр вируса при размножении в данной культуре составляет 7,4 9 БОЕ/мл.а в параллельно инфицированной аноло-гичным способом Культуре клеток почекобезьян - 6,45 д БОЕ/мл,76 4391 ся легкостью получения и субкультивиров ани я при и спол ьзов анин ростовой среды Игла или среды МЕМ с добавлением 10 качественной сыворотки крупного рогатого скота; не требует особых видо питательных сред и дефицитной эмбриональной сыворотки телят, обладает устойчивыми морфологическими и генетическими особенностями, Линия чувствительна ко многим вирусам, что открывает перспективы широкого применения ее в вакцинном производстве. Ее клетки хорошо сохраняются в жидком азоте и можно создаватЬ их запас.- Использование линии в производстве вакцин позволит снизить импорт обезьян и готовить большие партии вакцин на заранее отконтролировайном клеточном субстрате. Применение его в качестве лабораторной модели вместо первичных культур клеток и животных позволит получать более достоверные данные с меньшими экономическими затратами. П р и м е р 7. Способ культивирования вируса клещевого энцефалита, штамм Софьин.Линию клеток на уровне 11 пассажа готовят аналогичным способом, описанным в примере 1, Культуру трижды отмывают раствором Эрла и вводят вирус- содержащую жидкость из расчета 0,002Ро /клетку . Адсорбцию вируса проводят при 32 С в течение 1,5 ч при постоянном покачивании, В качестве поддерживающей среды используют среду 199 на растворе Эрла с 5 аминопептида - 2, и по 0,1 % куриного эмбрионального экстракта, человеческого альбумина и гидролиэата лактальбумина. Культуры инкубируют при 37 оС в .течение 48 ч и производят сбор вируса.Степень его размножения определяют в опытах биологического титрова-. ния путем интрацеребрального эараже О ния мышей. При этом титр составляет 8,02 Ъ 9 ЕО 5 о Параллельно аналогичным способом инфицируют первичные культуры клеток 25 куриного эмбриона и титр вируса в этом случае равен 7 1 Ч 12 о.Предлагаемый способ позволяет испольэовать для культивирования вирусов нового субстрата, полученного из легко - ЗО доступного абортивного материала (к 6- жи и ьишц эмбриона человека), легко культивируемого, обладающего диплоидным набором хромосом, свободного от посторонних агентов, чувствительного к различным вирусам, лишенного онко- генной активности.Линия диплоидных клеток кожи и цыц эмбриона Мчеловека отличаетФормула изобретения Способ культивирования вирусов путем размножения на линии диплоидных клеток, о тли ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения способа, вирусы размножают на линии диплоидных клеток кожи и ьвшц эмбриона человека М. Источники информации,принятые во внимание при экспертизе 1, НауГ 11 с 1 апд НоогЬеад, ТЬе 5 ега 1 Сц 11 ча.йоп о Ород Се 1 5 сга 1 пэ. "Ехрег 1 аепйа 1 Се 1 ц 1 ог йеьеагсИ", 25, 3, р, 585-621, Э акаэ 5 769/40 Тираж 528 Подписное ВН 1 ИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5