Способ получения (+) салютаридина

(31) 331394 (33) СШАОпубликовано 15,03.76. Бюллетень10 Государственный комитет Совета Министров СССР ло делам изобретенийи открытий(53) УДК 615,32(088.8) Дата опубликования описания 01.07.76(72) Авторы изобретения Иностранцы Эрвин фредерик Шоеневальдт и Эрнел Дин Айнен(США) Иностранная фирма Мерк энд Ко., Инк.(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ (+) САЛЮТАРИДИНА Изобретение относится к фармацевтической промышленности,Известен способ окисления ретикулина в салютаридин.Однако известный способ обеспечивает невысокий выход целевого продукта.С целью повышения выхода целевого продукта в предлагаемом способе окисление осуществляют ферментативным путем с использованием культур микроорганизмов классов БсИкоптусе 1 ез или Ецтпусе 1 ез.При осуществлении способа превращения ( - ) ретикулина в (+) салютаридин штаммы Яс 1 ткоптусе 1 ез или Ецптусе 1 ез выращивают в водных питательных средах в присутствии( - ) ретикулина в течение промежутка времени, необходимого для выполнения превращения. Время и условия для выполнения такого процесса ферментации меняется в зависимости от конкретных свойств используемого микроорганизма. Организм выращивают при аэробных условиях в питательных средах, которые пригодны для роста этих микроорганизмов. Температура для ферментации зависит от конкретного микроорганизма, но обычно процесс протекает при 24 - 37 С, при этом наиболее подходящей температурой для осуществления процесса ферментации является 28 С. Концентрация ( - ) ретикулина в ферментационной жидкости колеблется в пределах 10 - 50 мг/100 мл жидкости в зависимости от специфики применяемого микроорганизма. Проводя процесс ферментации ( - ) ретикулин 5 асептически добавляют в стерилизованнуюсреду в виде водного раствора с концентрацией рН=4,5 - 6,7, после чего выращиваемой культуре дают возможность расти в течение достаточного времени, обычно в течение 3 - 10 10 дней до накопления максимальных количеств (+) салютаридина. Или ратикулин добавляют в бродильную жидкость уже после того, как развернулся процесс ферментации и некоторое время протекал, а затем фермента цию продолжают до завершения образованиясалютаридина. Также ретикулин вводят в надежный контакт с окислительными фенолсвязующими ферментами, создаваемыми за счет ферментации селектированных (отборных) 20 микроорганизмов, например, путем тесногоконтактирования ( - ) ретикулина с покоящимися клетками штамма, который содержит требуемые ферменты,Водные ферментационные среды, использу.25 емые при создании препаратов, приготавливают по способам, известным для выращивания микроорганизмов, применяемых в производстве антибиотиков, Такие среды содержат усвояемые источники углерода и азота, а такжснеорганические соли, включающие микровключения металлов, необходимых для соответствующей жизнедеятельности (метаболизма, обмена веществ) микроорганизмов,В основном углеводы типа сахаров, например декстроза, сахароза, мальтоза, лактоза, декстрин и т. п., и крахмалы служат подходящими источниками ассимилируемого (усвояемого) углерода в питательных средах. Количество углевода колеблется в пределах 0,1 - 6 от веса среды. Эти углеродные источники применяют по отдельности, либо несколько таких углеродных источников соединяют в среде.Различные азотные источники, такие, как казеиновые гидролизаты, кашевидные выварки из муки соевых бобов, муки арахиса, муки жмыха земляного ореха, фильтрат барды, кукурузные соки и т, п., легко усваиваются микроорганизмами.Получаемый в результате процесса (+) салютаридин легко извлекают путем экстрагирования щелочной фильтрованной жидкости посредством подходящего водного несмешивающегося растворителя, например этилацетатом или бензолом, Затем раствор очищают очередной экстракцией, разделением диффузией через перегородки между щелоч ными водными растворами продуктов ферментации и водными несмешивающимися растворителями или с помощью средств хроматографии жидкостей или тонкопленочной хроматографии на двуокиси кремния и т. п. Окислительные фенолсвязующие ферменты превращают ( - ) ретикулин в (+) салютаридин и продуцируются видами микроорганизмов ЯсЫкогпусе 1 ея и Ецтусе 1 ея.Культуры этих организмов хранятся в коллекции культур Позер н Риджэнэн Рисарч Лэбраториа Министерства (Департамента) сельского хозяйства - института, расположенного в Пеории штат Иллинойз, и где значатся под номерами МКК 1.Ряецс 1 огпопая яр МВ 3119 - ХКК 1. 5686 Ягер 1 огпусея яр МА 4382 - МКК 1. 5688 Ягер 1 огпусея яр МА 4383 - МКК 1. 5689 Ягер 1 отусея яр МА 4384 - ККК 1. 5690 Ягер 1 огпусея яр МА 4390 - ККК 1. 5691 51 гер 1 опчусея дг 1 яеця МА- ЫКК 1. 5687 Другие микроорганизмы, которые необходимы для процесса, предлагаемого изобретением, подпадают под класс Ецгпусе 1 ея, а именно подклассы Рйусогпусе 1 ея и Рцпр ппрег 1 ес 11 класса Ецгпусе 1 ея, включают разновидности родов Мцсог, Сцпп 1 пфагпе 11 а, Яупсерйа 1 ая 1 гшп, Ь. Хецгоярога и РагаИе 11 а подклассов Мцсога 1 ея и Ьрйоег 1 а 1 ея, а также родов Реп 1 с 1111 цгп Аярегр 11 ця, Тогц 1 а и Яег 1 рпа 1 осуя 11 я подкласса Гцпр ппрег 1 есИ.Следующие культуры были навечно помещены в Коллекцию культур Департамента сельского хозяйства США - Позери Риджинал Ресорч Лабораторна, г. Пеория, штат Иллинойз,5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 они зарегистрированы под следующими номерами КК 7Сцпп 1 прйагпе 11 а яр. МР 4547 - ККК 1. 5695 Аярегр 11 ця яр. МГ 4536 - ККК 1. 5694 Тогц 1 а сгегпопя МУ- ККК 1. 47495 Мецгоярога яр. МР- ККК 1. 5692 Реп 1 с 1111 цт с 1 чгуяодепшп МР 3965 - ХКК 1.5693П р и м е р 1, Одну лиофилизированную пробирку культуры микроорганизмов Рагая 1- 1 е 11 а я 1 гпр 1 ех АТСС 6476 суспендируют в 10 мл стерильной основной среды. 0,3 мл полученной суспензии используют для засева каждых 10 мл стерилизованной основной среды, содержащей 3;х,10 -г ретикулина, в тест- пробирках размером 25 К 150 мм. Эти пробирки с полученным препаратом инкубируют при 28 С в течение 5 дней на аппарате, обеспечивающем вращательно-встряхивающее движение. Затем эти пробирки снимают со встряхивателя и добавляют 1 мл 0,5 М динатрийфосфата, отрегулированного до значения рН= =8 с помощью ЫаН,Р 04, после чего добавляют 2 мл этилацетата, Эту смесь подвергают энергичному встряхиванию до получения высокодисперсной (ровной) эмульсии. Затем эту эмульсию переносят в специальную пробирку для центрифугирования и подвергают центрифугированию на протяжении достаточного промежутка времени, чтобы расслоить эмульсию на фракции растворителя и водную. Затем полученный экстракт этилацетата подвергают анализу посредством жидкостной хроматографии и тонкопленочной хроматографии, тем самым показывая наличие салютаридина.Основную среду препарировали путем растворения, г: декстрозы - 10; солодовой вытяжки - 3; дрожжевого экстракта - 2, питательного бульона (1 Исо) - 8 в достаточном количестве воды, с тем, чтобы обеспечить 1 л среды. Перед тем, как ее использовать, регулируют рН этой среды до значения 7,0 за счет добавления гидроокиси натрия. При использовании в качестве твердой (питательной) или поддерживающей среды в ее состав включают агар в количестве 20 г/л. Стерилизацию производят путем автоклавирования сред в течение 20 мин при 121 С,Ретикулин добавляют асептически как стерильный водный раствор, Этот раствор препарировали путем растворения 6 мг в 1 мл воды, регулируя при этом значение рН до 7 и осуществляя стерилизацию посредствомфильтрации.Препарированный этилацетатовый экстракт подвергают (пробирному) количественному анализу на наличие салютаридина с помощью средств жидкостной хроматографии на анионообменной смоле или силикагеле.Ферментационные бульоны, дающие положительные результаты в общей классификации (сортировании, отборе) посредством жидкостной хроматографии, перепроверяются с помощью двух различных систем тонкослойной хроматографии, Для этой цели оставшуюся половину этилацетатного экстракта данного бульона разделяют и наносят на пластины для тонкослойной хроматографии в двух местах (точках) на каждой из двух пластин. Одна из этих точек суть присадка (или смесь, примесь) с подлинным (+) салютаридином, которая позволяет производить наблюдение совпадения с точкой полученного вещества и фигурирует как еще одно доказательство помимо значения И, Чистый образец (пробу) (+) салютаридина также наносят вдоль двух вышеуказанных мест на пластине, Проработанные пластины визуально наблюдаются посредством ультрафиолетового поглощения (гашение свечения пластин, подверженных воздействию ультрафиолетового излучения) и посредством цветовой реакции, вызванной парами 1.(+) Салютаридин покидает ооласть возникновения (Кт 0,3) и при воздействии 1 - паров он приобретает характерный серый цвет, который вскоре превращается в желтый. Пример 2. Суспензию РагаНе 11 а этптр 1 ех АТСС 6476, препарированную аналогично примеру 1, используют для посева через стерильную петлю на поверхность скошенного агара, содержащего основную среду, Затем эти скосы инкубируют в течение 5 дней при 28 С, наблюдая при этом великолепный рост культуры, Несколько полных петель такого гриоа из инкубированного скоса используют для посева в 40 мл стерильной основной среды, 1 мл полученной суспензии используют для посева в каждую из тридцати колб Эплеттмейера емкостью 250 мл, содержащих 40 мл стерильной основной среды, плюс 300 мкг/мл ( - ) ретикулина, Полученные таким образом инокулированные колбы. а также контрольные колбы (без ретикулина) инкубирутот при 28 С в течение 5 дней на ротационном встряхивателе. В это время были сгруппированы (собраны) колбы, содержащие ретикулин, после чего проводят количественный анализ на салютаридитт как для ферментационного бульона, содержащего ретикулин, так и для контрольного бульона. Контрольные бульоны не содержали салютаридина, тогда как бульоны, содержащие ретикулин, имели в своем составе салютаридин.П р и м е р 3. Скошенную культл Рагавт 1 е 11 а з 1 птр 1 ех АТСС 6476, описание которой имеется в примере 2, применяют для инокулирования 40 мл основной среды в колбах Эрленмейера емкостью 250 мл, после чего систему инкубируют на протяжении 2 дней (2 сут) на встряхивателе при 28 С. 1 мл полученной посевной (семенной) культгрьт используют для инокулирования каждой из 60 колб, содержащей 40 мл основной среды с 300 мкг/мл ретик лина. После проведения инкубации при 28 С в течение 5 сут на встряхивателе полученные ферментационные бульоттьт подвергают количественному анализу.В результате анализа в бульоне содержится салютаридин.Пример 4. Одну полную петлю Рагазт 1 е 11 а зттпр 1 ех АТСС 6476 переносят со скошенной культуры 10 мл стерильной основной среды.0,25 мл полученной суспензии используют для инокуляции тест-пробирок (размер 25 р, 150 мм), содержащих 10 мл стерильной основной среды и 300 мкг/мл ретикулина. Эти инокулированные пробирки ипкубируют при 28 С на ротационном встряхивателе, Отдельные пробирки выводят из эксперимента через 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 дней инкубацин и подвергают количественному анализу на наличие салютаридина. Ниже приведены количественные данные салютаридина, содержащегося в ферментационных бульонах: 5 10 15 20Время инкубации,сут Образовавшееся количество салютаридина,10г/мл 0,5 0,9 3,6 1,4 3,5 2,9 5,7 5 6 7 8 9 10 25 Зо 35 40 45 50 55 60 65 П р и м е р 5. Бульон, полученный путем ферментирования 2250 мл основной среды, содержащей 675 мг ретикулнна (как описано в примере Зт делают цтелочным, доведя значение рН до 8,1 за счет добавления 14,2 г динатрия фосфата, Полученную смесь перемешиватот с 500 м, этилацетата и профильтровывают. Водный слой фильтрата экстрагируют двумя порциями этнлацетата по 350 мл и полученные комбнннрован;.тые экстракты высушивают на натриевом сульфате и подвергают концентрации в ваюухте. Полученный в результате остаток (осадок) разделяют между 100 мл 4%-ного раствора гидроокисн натрия и 100 мл бепзола под азотом. Отделенный водттый слой промывают дополнительной дозой бензола и затем окисляют до значения рН 7,0 - 8,0 с помощью 85%-ттой фосфорной кислоты. Полученный щелочной раствор в азотной атмосфере экстрагируют хлороформом, после чего комбинированные экстракты высушивают и концентрируют. Остаток подвергают исследованию посредством методов хроматографии на трех пластинах двуокиси кремния с использованием 20% -ного метанола в хлороформе в качестве проявляющего растворителя, Посредством ультрафиолетовых лучей на проявленных пластинах обнаруживают две большие полосы и отделяют соскабливанием. Соскобленный материал, в котором имеется двуокись кремния, перешедшая из основания - пластинки, экстрагируют метанолом, затем испаряя метанол получают твердый осадок из его паров, который вновь экстрагируют дихлорметаном, что приводит к получению материалов, свободных от со10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 держания двуокиси кремния. Более медленно двиакущаяся полоса Ду 0,6; 3,0 мг) была идентифицирована как изосалютаридип. Продукт быстрее движущейся полосы фу,65) требовал дальнейшей очистки, которая выполнена на окисноалюминиевых (двух) пластинах с использованием хлороформа в качестве растворителя (Ру 0,5), Выделение (извлечение) продукта из полосы позволяет получить 13,4 мг салютаридина в виде желтого кристаллического твердого вещества. Кристаллизация от 0,2 мл этилацетата дала 7,1 мг бледно-желтых кристаллов. Т. пл. 212 в 2 С; а 1 о +14,7+7,8 (С 0,48, КаОН); Л КаОН 280 нм (Х = 6050), 241 нм (Х 18900): ядерный магнитный резонанс макс. (С РС 1 а) 2,66 (Са - Н), 3,47 (АВ квартет, С 1 - Н и С - Н) 3,83 (Са - Н), 6,21 и 6,34 (ОСНа) и 7,61 частей на миллион (ХСНа), накладываемые с подлинным (образцом, пробой) (+) салютаридина.Масс-спектрограмма: М 327, м/о 312, 299, 284.Для изосалютаридина (СРС 1 з) т 3,37 (Сь - Н), 3,46 (С 4 - Н), 3,80 (С 1 - Н), 3,83 (Сз - Н), 6,19 и 6,28 (ОСНз) и 7,59 частей на .миллион (И - СНа) все синглеты.П р и м е р б. 1 л стерилизованной основной среды, содержащей декстрозу, солодовую вытяжку, дрожжевой экстракт и питательный бульон (Р 11 со), а также 400 мг ( - ) ретикулина НС 1 2 НаО эквивалент 339 мг ( - ) ретикулиновой основы инокулируют культурой РагаИе 1 а з 1 гпр 1 ех АТСС 6476 и инкубируют посредством аэрации в течение 6 дней при 28 С. К полученной в результате аэрации ферментационной жидкости (бульон) добавляют 100 мл 0,5 М двунатриевого фосфата и 250 мл бензола. После тщательного перемешивания смесь профильтровывают, органический слой отделяют, а водную фазу экстрагируют дополнительным количеством в 250 мл бензола. Комбинированные бензоловые экстракты высушивают над натриевым сульфатом и экстратируют двумя порциями по 50 мл 1 н. раствора гидроокиси натрия в атмосфере азота. Комбинированные щелочные экстракты подвергают обратной промывке бензолом, окисляют до значения рН 7,5 с помощью 85%-ной фосфорной кислоты и дважды экстрагируют посредством 200 мл бензола, Комбинированные бензольные экстракты сушат над сульфатом натрия и концентрируют до состояния полного высыхания в вакууме с целью получения остатка неочищенного (+) салютаридина. Этот остаток исследуют средствами хроматографии с выходом фракции (+ ) салютаридина, позволяющей кристаллам от этилацетата плавиться при 191 - 194 С (т, пл. подлинного (+) салютаридина 190 - 194 С) .П р и м е р 7, Большос количество идентичньтх пробирок, содержащих стерилизованную основную сред, и 300 мкг ( - ) ретикулина/мл, инокулируют культурой РагазИе 11 а з 1 гпрех8АТСС 6476 и инкубируют при тех же условиях, которые указаны в примере 1. Спустя 3 дня после инокуляции выводят пробирки- дубликаты, определяют значение рН и проводят количественный анализ бульона, Ниже приведены количественные данные салютаридина, содержащегося в ферментационном бульоне. Срок выдержки,сутКоличество салютаридииа,мкг/мл0,1 1,1 2,8 1,1 3,9 3,4 5,6 5,1 4,4 4,7 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 7,2 7,6 8,0 8,0 8,1 8,3 8,5 8,7 8,8 8,8 Формула изобретенияСпособ получения (+) салютаридина путем окисления ретикулина, о т л и ч а ю щ и йся тем, что, с целью повышения выхода цеПри м ер 8. В сушильную чашу поместили 500 мл стандартной основной среды, содержащей 300 мкг/мл ретикулина. Поверхность этой среды инокулируют путем спринцевания споровой суспензией Рагазйе 11 а зппр 1 ех АТСС 6476 и инкубируют при 28 С на протяжении 5 дней. За это время плотную насыщенную и массивную пленку, которая выросла на поверхности, снимают и переносят из первоначальной чашки в другую, содержащую только 500 мл 0,1 н, ацетатного буферного раствора (рН=5,0). Эта пленка плавает в течение 1 ч на поверхности буферного раствора, слегка покачиваясь и затем ее снова переносят в чашу, содержащую точно такой же буферный раствор плюс 0,1% декстрозы и 300 мкг/мл ретикулина (3(10 - 4 г/10 -л или 0,3 г на 1 л), Затем эту чашку инкубируют при 28 С в течение еще 6 сут, Получают результаты количественного анализа на среде первоначального роста в течение 5 дней и на заключительной среде покоящихся клеток за 6 дней. Первоначальная питательная среда содержала 1,3 мкг/мл (+) салютаридина в момент переноса, а среда покоящихся клеток 2,13 мкг/мл по истечении 6 дополнительных дней, В фазе покоящихся клеток не отмечалось заметного дополнительного роста микроорганизмов,П р и м е р 9, Различные стерилизованные среды, содержащие 300 мкг/мл ( - ) ретикулина инокулируют микроорганизмами РагазИе 11 а з 1 гпр 1 ех АТСС 6476, и в течение 4 дней наблюдают их рост, после чего производят количественный анализ на содержание салютаридина,Редактор Т. Девятко Корректор О. Тюрина Заказ 1319/3 Изд.1318 Тираж 629 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 13035, Москва, Ж, Раушская наб.д, 4/5Типография, пр. Сапунова, 2 левого продукта, окисление осуществляется ферментативным путем с использованием 10культур микроорганизмов классов ЗсЫготусе 1 ез или Ешпусе 1 ез.