Всесоюзная i.; ., г; .; л vrviiwmffk-: i ila till • tit1 i. anss”t. tri-n i bhb. flotsha

300992 ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК ПАТЕНТУ Союз Советских Социалистических РесптбликЗависимый от патента МПК С О 7 с 103/52 аявлено 15.Н 1.1969 ( 1349142/23-4) ФРГ иоритет 15.ЧП.1968,Р 176893 Комитет по делам изобретений и открыти при Совете Министров СССРубликова 971. Бюлл а опубликования описания Авторытзобретения Иностранцы Ойген Верле и Ханс фритц едеративная Республика Германи Иностранная фирма фарбенфабрикен Байер А, Г. едеративная Республика Германиявит ЕЛЕНИЯ ПОЛИПЕПТИ ПОС Известен способ выделения полипептидов, заключающийся в том, что полипептид-(1) ковалентно связывается с растворимым или нерастворимым носителем и получающийся в результате этого аддукт приводится в воде в соприкосновение с раствором, содержащим полипептид, способный образовывать с полипептидом-(1) соответствующий комплекс, который очищают путем промывания или хроматографическнм способом, переводят далее в диссоциированное состояние действием киС. лого буфера и затем элюируют целевой продукт. Для выделения ингибиторов энзимов энзим, ингибированый соответствующим ингибитором энзимов, ковалентно связывается с соответствующим носителем, получающееся нераст. воримое в воде вещество вводится в соприкосновение с раствором ингнбитора энзимов и образующийся комплекс очищается посредством промывания, переводится далее в диссоциированное состояние и затем отделяется ингибитор энзимов.Применяющиеся в известном способе нерастворимые или растворимые носители представляют собой главным образом полимерные вещества, которые должны содержать функциональные группы, способствующие в соответствии с методами химии пептидов протеканию химической реакции с вышеуказанными полипептидамн, энзимами и ингибиторами пен. тидов, Среди вышеупомянутых полимерных продуктов в первую очередь следует указать такие макромолекулярные продукты, которые содержат в своем составе ангидридные, хлорангидридные, изоцианатные, а также азидные группы и, кроме того, такие смолы, которые содержат активированный атом фтора. Могут применяться также и известные, содержащие в составе своих макромолекул карбоксильные группы, ионообменные смолы, В силу вышеуказанного обстоятельства большинство из приведенных продуктов обозначается как А-смолы. При введении в вышеупомянутые смолы групп основного характера получают так называемые полиаморфные смолы, в которых один отрицательный заряд смолы ослабляется до приблизительно нейтрального; такие смолы в последующем изложении будт обозначаться как М-смолы.В результате исследований было найдено, что известный способ может быть в значительной степени улучшен, если в качестве носителя использовать М-смолу, так как они имсчот в большинстве случаев значительно более высокую способность к связыванию, чем А-смолы. При применении этих смол подлежащие выделению вещества могут быть изолированы при значительно более мягких условиях, например при значительно более низком значении рН, чем в случае применения А-смол. Кроме того, И-смолы связывают также энзимы и ингибиторы энзимов с гораздо более низким изоэлектрическим потенциалом, причем при аналогичном значении изоэлектри и- ского потенциала А-смолы или совсем не связывают вышеуказанные вещества, или свчзывают их только в незначительном количестве. Так, например, Х-калликреин-ингибигорная смола связывает калликреин, который совершенно не связывается А-калликреин-ин гибиторной смолой, или смола на основе Х-трипсина связывает ингибиторы, выделенные из соевых бобов, куриного белка, а также из сыворотки, которые с помощью смолы А-трипсина или не связываются совсем, нли связываются в очень незначительной степени.И-смолы получаются в том случае, если система, состоящая из вещества-носителя и энзима или из вещества-носителя и ингибитора энзима, соответствующим образом совмещается с алифатическим или/и ароматическим нолиамином, у которого свободна только одна аминогруппа, а остальные аминогруппы защищены ацильными группами. В качестве аминов могут быть использованы, например, Х,й-диметилэтилендиамин, агматин, И-метил- И-(З-аминопропил)-пиперазин, 4-аминопиридин, 2-аминопиридин, 3-амино-циклогексиламинопропан и другие.По предлагаемому способу получающиеся и фиксирующиеся на И-смоле комплексы в целях удаления сопутствующих веществ и загрязнений, присутствующих в составе препарата, основательно промываются водой и буферными растворами, после чего образовавшиеся комплексные соединения переводятся в диссоциированное состояние путем изменения рН реакционной смеси, и/или путем изменения концентрации ионов, и/или путем вытеснения с помощью конкурентноопособных и тормозящих соединений или субстратов для трипсина, таких, как, например, триптамин или я-бутиламин, и(или путем добавления таких продуктов, которые, как, например, мочевина и соли гуанидина, способствуют ослаблению или полному прекращению молекулярного обменного взаимодействия, что в соответствующих случаях производится путем обратимого денатурирования использующихся протеинов.Среди энзимов, которые могут быть сконцентрированы из собственных в большей или меньшей степени загрязненных растворов; а затем очищены и выделены, в первую очередь следует отметить такие продукты, как, например, трипсин, химотрипсин, калликреин, плдзмин, пенсии, ренин, рибонуклеаза, тромбин, амилаза, параин, гиалуронидаза, карбопепгидаза А и Б, панкреитопептидаза Е, пенициллиназа и холинэстераза.Среди ингибиторов энзимов, которые могут быть очищены, сконцентрированы и выделены, используя предлагаемый способ, в первую очередь следует отметить обычные извесгцые ингибиторы типа калликреинтрипсина (инги 5 10битор Кунитца, тразилол К), специфические, например, оказывающие ингибирующее действие исключительно на трипсин, так называемые ингибиторы трипсина, получаемые из панкреатических желез свиней и крупного рогатого скота, из семенных пузырей и из семян растений и картофеля.Помимо вышеуказанного предлагаемый способ концентрирования энзимов и их ингибиторов представляет возможность подыскивать новые ингибиторы для известных в настоящее время энзимов и, наоборот, подыскивать новые энзимы, которые могут быть ингибироааны при использовании соответствующих инги биторов энзимов, В первом случае соответствующий энзим ковалентно связывается с всществом-носителем и после этого образовавшийся в результате аддукт обрабатываегся растворами, которые содержат соответствую щие ингибиторы для подвергающегося обработке энзима, в течение такого промежутка времени, пока не уменьшится биологическая активность данного энзима. В последнем случае процесс осуществляют аналогичным 25 образом, но в обратной последовательности.Преимуществом предлагаемого способа концентрирования энзимов и их ингибиторов является возможность обрабатывать также и такие полипептиды, энзимы и их ингибиторы, ЗО концентрирование которых из их загрязненных растворов ранее было связано с серьезными затруднениями, а в некоторых случаях было просто невозможно, причем указанное концентрирование, последующая очистка н 35 выделение производятся очень простым способом с хорошими выходами и степенью чистоты.П р и м е р 1. Получение водонерастворимойсмолы Х-трипсина.40 200 мг смолы ЕМАфирмы Монсанто добавляют при перемешивании к охлажденной до 0 - 4 С смеси, состоящей из 20 мл 0,10/о-но.го гексаметилилендиамина и 75 мл солянобуферного раствора (0,1 М триэтаноламина, 45 0,1 М поваренной соли) с рН 7,8. Полученнуюсуспензию гомогенизируют в течение непро должительного времени, перемешивают и че рез 2 мин после добавления смолы совмеща.ют с охлажденным до 0 - 4 С раствором 1 г 50 трипсина в 75 мл соляно-буферного раствора.По истечении 4 мин медленного перемешива.ния полученную реакционную смесь совмещают с водным раствором 4 г И,Х-диметилэтилендиамина (1:1), рН 7,8 устанавливают с 55 помощью 2 Х раствора НС 1, Охлажденнуюреакционную смесь перемешивают 2 час и центрифугируют. В образовавшемся растворе находится еще 320 мг трипсина, что означает, что 68% взятого в реакцию трипсина связы вается с водонерастворимой смолой. Полученную водонерастворимую смолу И-трипсина смешивают с двойным объемом порошка целлюлозы Целлекс ХФ, после чего выливают в охлажденную до 0 - 4 С колонну и затем про.65 мывают (как правило в течение ночи) соляно 300992буферным расгвором, состоящим из 0,1 М триэтаноламина, 0,1 М поваренной соли и 0,01 М хлористого кальция и с рН 7,8, пока в промывочной жидкости больше не будет обнаруживаться трипсин. Аналогично смолу Х-трипсина получают при использовании вместо Я,Х-диметилэтилендиамина других аминов; П р и м е р 2. Выделение ингибиторов с помощью смолы Х-трипсина,а) Специальный ингибитор трипсина из папкреатических желез свиней.Экстракт, образующийся при обработке высокомолекулярного белкового вещества из панкреатических желез свиней 3/,-ной перхлоркислотой, содержит ингибитор, удельная активность которого составляет 0,014 1 п 1.1 на 1 мг биурет-протеина. 1 1 пЛ 1 для трипсина ингибирует около 1 мг Тгурцге 1 Чочо К.Смолу И-трипсина, полученную из 10 г трипсина, прибавляют к нейтральному раствору, содержащему ингибитор (2,14 л, 745000 1 пЛ.1 для трипсина), при охлаждении до температуры 0 - 4 С. После медленного перемешивания в течение 2 час при температуре 0 - 4 С реакционную смесь центрифугируют, отбрасывая жидкую часть, Образовавшийся нерастворимый комплекс ингибитора со смолой трипсина после этого трижды перемешивают с соляно-буферным раствором, содержащим в своем составе 0,1 М триэтаноламина, 0,1 М поваренной соли и 0,01 М хлористого кальция, при температуре О - 4 С и образовавшуюся при центрифугировании жидкую фазу вновь отбрасывают. Затем комплекс со смолой вносят в 0,2 М раствор хлористого калия, величину рН суспензии устанавливают равной 2,0 путем добавления соответствующего количества 2 И раствора НС 1 и после добавления соляной кислоты реакционную массу перемешивают при охлаждении в течение 1,5 час. Наконец, вышеуказанную суспснзию снова центрифугируют и образовавшийся остаток, состоящий из смолы-энзима и смолы- комплекса, еще один раз, как это описано выше, обрабатывают 0,2 М раствором хлористо= го калия с соляной кислотой, рН которого равно 2,0. В объединенных жидких фазах, образовавшихся в результате центрифугирования, находится такое количество ингибитора, которое составляет 68,50/, взятого для выделения количества, Удельная активность препарата ингибитора составляет 0,32 1 пй)/мг биуретпротеина, а после отделения соли на колонке, наполненной Сефадексом - Г(ДекстранГель фирмы фармакиа, Уппсала, Швеция), она составляет 2,73 1 в 11/мг биурет-протеина.Вымывание при использовании И-смолы происходит в значительно менее кислой области, чем для А-смолы.б) Поливалентный калликреиновый ингибитор из органов крупного рогатого скота.Ингибитор Кунитца (тразилол К) концентрируют аналогично концентрированию ингиби 5 ю 15 го 25 зо З 5 40 45 50 55 60 65 тора трипсина из панкреатических желез свиней с использованием смолы И-трипсина. Исходным материалом для получения вышеуказанного ингибитора служит технический ингибитор на основе калликреина. При использовании смолы И-трипсина образуется с выходом 86 чистый калликреиновый ингибитор с удельной активностью 3,75 1 пЛ.1/мг биуретпротеина.в) Ингибитор из бобов сои.Трипсин - химотрипсин-ингибитор из бобов сои (мол. вес, продукта 23000) получают и концентрируют аналогично описанному выше.Исходным препаратом служит технический препарат ингибитора (ингибитор из бобов сои, практически лиофильный, фирмы Серва, Гейдельберг) с удельной активностью 0,36 1 т(Ямг биурет-протеина для трипсина. 149400 1 гп(.1 для трипсина полностью связываются на нейтральной сйоле Х-трипсина, полученной из 5 г трипсина. После одночасового перемешнвания комплекса М-трипсиновая смола-ингибитор в 0,3 М буферном растворе хлористый калий- соляная кислота в жидкую фазу, образующуюся после центрифугирования, переходит 135 000 1 гпК что составляет 90 связанного количества. Удельная активность выделенного из бобов сои ингибитора после отделения солей при прохождении через колонну, наполненную Сефадексом - Г(120)(3 см) и промываемую 0,1 М буфером на основе коллидинацетата с рН 8,0 составляет 2,0 1 гп 11/мг биурет-протеина, что соответствует приблизительно 6-кратному концентрированию.П р и м е р 3, Получение водонераствори мой ингибитор- (тразилол К) -смолы.Для получения анионной А-смолы к 23 мл 0,2 М фосфатного буфера с рН 8,0 и 2,0 мл 0,10/-ного раствора гексаметилендиамина (ГМД) добавляют 120 мг смолы ЕМАпли ЕМАфирмы Монсанто, гомогенизируют в течение непродолжительного промежутка времени, затем перемешивают и через 5 мин (при использовании смолы ЕМАчерез 3 мин) после добавления смолы совмещают с раствором 200 мг (около 600000 1 гп 11 для трипсица) трипсин-калликреинового ингибитора в 30 мл вышеуказанного фосфатного буфера. Реакционную смесь перемешивают 16 час в холодильнике, затем центрифугируют и определяют несвязанное количество ингибитора в жидкости, образовавшейся в результате центрифугирования. Осадок после центрифугирования представляющий собой смолу - ингибитор, многократно промывают 0,2 М триэтаноламинным буферным раствором с рН 7,8 до тех пор, пока промывные воды не будут содержать в своем составе ингибитор. Все вышеперечисленные операции производятся при температуре 0 - 4 С.Для синтеза нейтральной И-смолы все исходные компоненты используются такие же, как указано выше. Через 8 мин после добавления раствора ингибитора к суспензии смоВремя перемешиванияпосле добавления ГМДили 1 ч 1 чД,мин Количество ингибитора, связанное со смолой, о Смола А-смола 92 81 32 ЕМАЕМАЕМАг 1 -смолаИэ-смола Количество ингибитора, связанноев смоле, 11 ц (для трипсина) Адсорбированноеколичество энзима,Тип ингибиторной смолылы (марки ЕМА) к полученному раствору дополнительно прибавляют раствор 1,6 г 1 ч,Х-диметилэтилендиамина (ЯчД) в небольшом количестве воды (объемное соотношение 1:1 с рН 1,8, устанавливаемым с помощью 2 Х соляной кислоты. Полученную реакционную смесь перемешивают 2 час и центрифугируют. Образовавшуюся в результате центАдсорбпия и диссоциация трипсина и химотрипсина на анионных (А) и нейтральных ингибиторных смолах.Адсорбция. Ингибиторную смолу добавляют к 20 мл 0,1 М триэтаноламинного буферного раствора с рН 7,8, в состав которого помимо аминного компонента входят еще 0,1 М хлористый натрий и 0,01 М хлористый калий и после этого совмещают с избытком энзима, растворенного в небольшом количестве указанного буферного раствора. После перемешивания полученной реакционной смеси в течение 2 час (возможно также в течение ночи) ее центрифугируют и затем определяют оставшееся количество энзима в образовавшейся жидкой фазе. Нерастворимый комплекс - смола промывается буферным раствором срН 7,8, до тех пор, пока в промывных водах больше не будет наблюдаться энзиматической актив" В расчете на количество энзима, которое ингибируется в растворе таким же количеством ингибитора. При однократном применении смолы 27,3 мг (б 4%"); после четырехкратного применения 13 мг (30%"),рифугирования нерастворимую смолу-ингибитор повторно обрабатывают, как указано выше. Свойства 1 ч-смолы, при получении которой добавление хлоргидрата М,М-диметилэтилендиамина производится не через 8 мин, а уже через 5 мин к реакционной смеси, состоящей из смолы с ингибитором, представлены в табл, 1. ности. Все вышеперечисленные операции проводятся при температуре 0 - 4 С.Диссоциация и элюирование. После последней операции промывания нерастворимый 10 комплекс энзима с ингибиторной смолой суспендируют в - 50 мл 0,3 М раствора хлористого калия и необходимую величину рН суспензии устанавливают с помощью 2 1 ч раст.вора соляной кислоты. После 2 час перемеши вания суспензию, которая имеет кислую реакцию, вновь центрифугируют и определяют энзиматическую активность жидкой фазы, об.разовавшейся при центрифугировании. Для.совершенно полного вымывания энзима из 20 смолы промывку производят, как правило, 3 -4 раза порциями по 50 мл, пока в жидкой фа.зе, образующейся при центр ифугировани и, больше не будет обнаруживаться заметное ко личество энзима (табл. 2).Таблица 2 Вымытое количество энзима, т. е, общее адсорбированное количество эизима,%, при рН3,5 3,0 2,5 2,0 1,7 25 Для концентрирования калликреина с помощью нейтральной инги битор ной смолы (Хэ и Ма) перед адсорбцией растворяют кал.ликреин в 20 мл 0,1 М триэтаноламинного буферного раствора, который дополнительно 30 содержит в своем составе 0,1 М хлористогонатрия и имеет рН 7 - 8, и после растворения72 64 59 53 64 15 4,9 62 110,9 221,9 Предмет изобретения Составитель А. Акимова Редактор Т. Г. Шарганова Техред 3, Н, Тараиенко Корректор Л. Б. БадыламаЗаказ 1319/13 Изд.589 Тираж 473 ПодписноеЦНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССРМосква, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Типография, пр. Сапунова, 2 ингибиторную смолу вносят в указанный раствор калликреина. После 14 час перемешивания (обычно в течение ночи, но в то же время вполне достаточно 2 час перемсшивания) центрифугируют полученную реакционную смесь и производят определение несвязанного калликреина в жидкой фазе, образовавшейся при центрифугировании. Нерастворимый комплекс калликреина и ингибиторной смолы промывается буферным раствором до полного освобождения от калликреина и протеина.Для трипсина 1 1 гпц ингибирует около 1 лг трипсина и соответствует 0,27 лг чистого ингибитора и 0,38 мг нашего препарата ингибитора." 1 КЕ (биологическая единица калликреина) выделяет около 0,7 нг протеина чистого калликреина.В расчете на количество энзима, которое ингибирует такое же количество ингиби-ора в растворе. Смола М-трипсин получена в соответствии с описанием данного изобретения; смола А- трипсин получена аналогично, однако без добавления М,И-диметилэтилендиамина,Элюирование калликреина из комплексакалликреина с ингибиторпой смолой производят с помощью 0,38 - 1 М раствора соли гуанидина, который доводится до необходимо го значения рН буфером на основе ацетатанатрия. Для полного вымывания калликреина его комплекс со смолой необходимо перемешивать от 4 до 5 раз порциями по 20 мл с раствором соли гуанидина в течение 1 час и 10 после этого отделить центрифугированием ингибиторную смолу, Результаты приведены в табл. 3,15 Способ выделения полипептидов путем взаимодействия полипептида- (1) с растворимым или нерастворимым носителем, обработки образующегося продукта в водной среде раствором полипептида, образующего с полипеп 20 тидом-(1) комплекс, очистки комплекса промыванием, переведением комплекса в диссоциированное состояние действием кислого буфера и элюированием целевого продукта, отличающийся тем, что продукт взаимодей 25 ствия полипептида-(1) и носителя обрабатывают алифатическим и/или ароматическим полиамином с одной свободной аминогруппой и защищенными ацильными остатками осталь. ными аминогруппами,