Способ получения пенистых клеток из макрофагов мыши

, СОЮЗ СОВЕТСКИХ СО ЦИАЛ И СТИЧ ЕСКИ РЕСПУБЛИК 492 и 33/554(51) ОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОВЕДОМСТВО СССР ОСПАТЕНТ СССР)(ГОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬ цина. Сущность изобретения: на четвертые сутки после внутрибрюшинного введения 103 гликогена мышам внутрибрюшинно вводят среду Хенкса, содержащую ацетилированные липопротеиды ту, низкой плотности или окисленный холестерин из расчета 2 и 1 мг холестерина на 18 г веса живого. Через ЕТОК 24 ч из перитонеальной полости мышейизвлекают макрофаги, трансформирован- и- ные в пенистые клетки, 3 табл.( СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯКРОФАГОВ МЫШИИспользование: б ПЕНИСТЫХ К ология Изобретение относится к биологии холестерина и содержайие холестерина .и медицине, .в частности к методам ис- в полученных пенистых клетках. . следования патогенеза и профилактики .Недостатки указанного способа заатеросклероза, ключаются в невысокой точности воспИзвестен способ получения пенистых . роизведения условий культивированияввввее клеток, схожих с клетками в атероскле- макрофагов, вариабельности йспользоротической аорте, из макрофагов, за- вания различных серий среды КРМ 1 - ключающийся в том, что полученные из : 1640, делипидизации сыворотки крови,перитонеальной полости мышей рези- . .в различии материалов прйменяемой дентные макрофаги культивируют в культуральной посуды, в трудоемкостиО пластиковых чашках Петри в среде : .метода культивйровдания макрофагов в ЬЭ ИРМУ, содержащей 2 мМ глутати-стерильных условиях, в исйользова- Я она, 10 делипидированную сывороткУ нии дорогостоящих питательных сред крови человека, 100 ЕД/мл пемицилли- и одорудоввния для клетоцнцх кульна, 100 мкг/мл стрептомицина и 100 мкг тур. Кроме того, культивирование белка модифицированных ацетилляцией макрофагов Ы часто йе позволяет липопротеидов низкой плотности (ЛПНП) моделировать процессы образования хов 1 мл среды, в течение 24 .часовпри, лестерин-обогащенных пенистых клеток37 С в атмосФере СО (53) и возду- в организмеха (95 ь), В конце исследования моно- Предлагаемый способ получения слой клеток промывают средой 199 и пенистых клеток в перитонеальной исследуют влияние антиатерогенных . полости организма жйвых мышей позфармакологических препаратов на ско- . воляет значительно упростить процерость включенияС-олеата в эфиры дуру метода, устранив выше перечисМи в перитонеальную полость вводили в мл среды КРМ 1 - 1640, содержащую 10, эмбриональную сыворотку телят, 2 мИглютатиона, 100 Ед/мл гентамицина, брюшную стенку массировали в течение 1 мин и аспирировали шприцом 4 мл перитонеальной жидкости, в которой с помощью камеры Горячева подсчитывали количество клеток. 2 мл среды, содержащей 2 О 6 клеток, вносим в пластиковые чашки. Петри диаметром 35 мм и инкубируем при 370 в течение 2-х .часов в атмосфере СО (53) и воздуха (95 ь). Клеточный монослой отмываем 4 раза средой ВРМ 1 - 1640 и полученные пенистые клетки характеризуем по скорости эстерификации холестерина и содержанию свободного и общего холестерина.Определение содержания свободного и общего холестерина в пенистых клетках, Экстракцию липидов из клеток проводим, добавляя 4 мл гексана и изопропанола в объемном соотношении 3:2 в каждую чашку Петри, в течение 30 мин. Экстракт сливаем в стеклянные пробирки иорганический растворитель упариваем в токе азота при 60 С. В сухом остатке определяем содержание общего и свободного холестерина в макрофагах энзиматическим методом с помощью набора реактивов "Вю-ЬаЬ- вхвйеш" (Финляндия).Оставший на чашках Петри после экстракции липидов клеточный белок растворяем в 1 мл 0,2 И ЮаОН и определяем концентрацию белка методом Лоури, Содержание холестерина выражаем в мкг в расчете на 1 мг белка.Определение скорости эстерификации холестерина в пенистых клетках. К полученному клеточному монослою вносим 2 мл среды КРМУ - 1640, содержащейО,Й альбумин и 0,2 мИ (1 - 1 ФС) олеата радиоактивностью 1 мкКи/мл среды. Клетки инкубировали в течение 6 часов при температуре 37 С в атмосфере СО (5 ь) и воздуха (953). После инкубации клетки промываем охлажденным до 4 С раствором Хенкса и проводим экстракцию липидов гексаном и изопропанолом в объемом соотношении 3;2 описанным выше способом. Разделение эфиров холестерина осуществляем методом тонкослойной хроматографии на пластинах (15 к 15 см) "Силуфол" (ЧССР) в двух системах растворителей;гексан:диэтиловый эфир: 3 1784922ленные недостатки, Преимущества йредлагаемого способа достигаются в результате способности макрофагов живых мышей накапливать большие количества холестерина и трансформироваться в пенистые клетки при внутрибрюшинном введении эмульсии окисленного холестерина или ацетилированныхлипопротеидов низкой плотности (ацетил-ЛПНП).Полученйй Йейистых клеток с высоким содержанием холестерина и скоро"стью его эстерификации осуществляютс помощью следующего метода:Окисление холестерина проводим навоздухе при температуре 60 С в течение 6 недель. 20 мг окисленного хо"лестерина растворяем в 60 мкл ацетонапри температуре 60 С и быстро вносим 20в 10 мл раствора Хенкса, содержащего504 бычий сывороточный альбумин (БСА),Раствор перемешиваем на магнитноймешалке под током азота, поступающего из баллона с азотом, в течение 25часа для удаления ацетона. Полученная эмульсия стабильная в течение24 часов. Липопротеиды низкой плотйости (1 019-1,055 г/мл) выделяем изплазмы доноров методом ультрацентриФугирования ЛПНП (5 мг белка вмлэаствора Хенкса) разбавляем (1: 1,7:Ч) насыщенным раствором ацетатанатрия при температуре 0 С. К разбавленному таким образом раствору ЛПНП(10 мг в 4 мл) периодически, одинраз в 15 мин в течение часа, вносимпо 2 мкл уксусного ангидрида с помощью микрошприца. АцетилированныеЛПНП диализуем против 20 л 0,05 Ифосфатного буфера, рН 7,4, 0,854хлористого натрия в течение 24 часов при 40 С. Полученные ацетилированные ЛПНП храним в течениетрехсуток при 40 С ,цДля стимуляции выхода макрофаговв перитонеальную полость 5-8 недельным мышам линии С 57 В 1 внутрибрюшинно вводили 1 мл раствора Хенкса, содержащего 10 гликоген. На четвертыесутки после введения гликогена мышам внутрибрюшинно вводим растворацетилированных ЛПНП или эмульсиюокисленного холестерина из расчета2 илимг холестерина на 18 г весамыши, соответственно. Через 24 часапосле последнего введения из перито неальной полости мышей получаем пенистые клетки, Для этого мышей забивали-гг 5 178492 :уксусная кислота в обьемных соот- ношениях 60 т 40: 1 и 90:10:1. Пластину проявляем в парах йода и радиоактивность эфиров холестерина подсчитываем в толуольном сцинтилляторе (4 гб 1 РРО,О, 3 г РОРОР на 1 л толуола) в жидкостном сцинтилляционном сцетчике "Марк" (США) по программе 2.Скорость эстерификации холестерина выражаем в кмоль включения фС-олеата в эфиры холестерина на 1 мг клеточного белка за 64 инкубации по следующей Формуле: 15Рад.кл х(С) Суб.вн мольРад.Суб клеточный белок в мг,где Рад.кл - радисактивность Эфирогвхолестерина клеток в,имп./мин;Рад.Суб - радиоактивность добавляемого субстрата Солеатав имп/мин;(олеата) а среде инкубации в нмоль.Определив таким образом концентрацию холестерина и его эфиров и скоростьэстерификации холестерина а полуценныхклетках, можно определить степень"трансформации макрофагов перитонеальной полости мышей в пенистые клеткии динамику накопления эфиров холестерина в клетках.П р и м е р 1. Исследование срав"нительного влияния нативных ЛПНП(1-2 мг холестерина/18 г массы животного), ацетилированных ЛПНП (0,4-2 мг 40холестерина/18 г массы животного),.очищенного перекристаллизацией холе-.стерина (1-2 мг холестерина/18 г массы животного) на содержание холестери-на и скорость его эстерификации в перитонеальных макрофагах мыши, Через24 часа, после внутрибрюшинного введения препаратов ЛПНП и холестерина по-,лучаем перитонеальные макрофаги и исследуем скорость эстерификации холестерийа. Результаты исследования,представленные в табл.1, показывают,что наиболее высокое (десятикратное)повышение скорости эстерификации хо-.глестерина наблюдается при введении мы-. 55шам ацетил-ЛПНП и окисленного холестерина в концентрации 2 и 1 мг холе-стерина/18 г массы мыши, соответственно. Как видно из табл.2, введение 2 6окисленного холестерина и ацетил-ЛПНП повышает концентрацию эфиров холестерина в клетках в 60 раз и уровень свобсдного холестерина в 2 раза по сравнению с контролем, Десятикратное повышение скорости эстерификации холе- . стерина и 60-кратное повышение содержания эфиров холестерина в перитонеальных макрофагах свидетельствует об их трансформации в типичные пени-стые клетки, характерные для ранних стадий развития атеросклероза.Предлагаемый способ позволяет полуцить пенистые клетки, которые могут быть использованы для изучения механизмов антиатерогенного действия . Фармакологических препаратов.П р и м е р 2. Исследование действия антагониста кальция верапамила. на скоростьэстерификации холестерина в пенистых клетках. Пенистые клетки, получаем,как описано выше после внутрибрюшинного введения окисленного холе" стерина (1 мг/18 г массы мыши) и по" следующего культивирования их а цаш" ках Петри. К среде для определения скорости эстерификациихолестерина, которое подробно изложено выше, микрошприцом вносим верапамил а 5 мкл этило-. вого спирта"йа 1 мл среды культивирования в конечных концентрациях 25,.50, 75 и 100 мкй. Табл.3 демонстрирует, цто верапамил дозозааисимо ингибирует скорость эстерификации холестерина в пенистых клетках, цто, вероятно, связано с его"айтиатерогенньм действием.Таким образом, предлагаемый способ позволяет получить пенистые клетки а условиях их естественной трансформации из перитонеальньх макрофагов живых мышей, которые могут быть использова- ны для изучения"мехайизмов атерогенеза и действия антиатерогенных препаратов.Формула изобретения Способ получения пенистых клеток из макрофагов мыши, включающий воз- действие на макрофаги мышей окисленным холестерийом йли минопротеида-ми низкой плотности, о т л и ц а ющ и й с я тем, цто, с целью повышения выхода жйзйеспособных клеток, воздействие осуществляют хп жчо внутрибрюшинным введением вещества а дозе 1"2 мг/18 г массы мыши, затем выдерживают в течение суток и целевой продукт извлекают аспирацией.178422 Таблица 1Скорость включения "фС-олеатав эфиры холестерина макрофагов,полученных после внутрибрюшинноговведения нативных и ацетилированныхлипопротеидов, холестерина и егоокисленных продуктов,(ййв) е а е в в а в е т ащ е ае а е т та еее в та Включение+С-олеатЬ вЭХС в нмольв течение б часов культивирования 1макрофагов ,Концентрация ХС в вводимом пре" парате в мг на 18 г веса мыши Группаживотных еще т тещи т итетиввиттиввета 0 3,56+0,063 1 7,41+0,48 2 11,250,52,: 0,4 6,47 й 0,381 18;9+1 311,5 30,08+1,76 ,2 36, 11+2,31 0,5 11123+0136 1,0 19,6+1,02 2,0 26,4 Д,26 0,5 14,4 0,521,0 34,8+1,35 щатт иветвееещететатеев ие Достоверность всех величин по от, ношению к контролю - Р0,001,Таблица 2Содержанйе холестерина в макрофагах привнутрибрюшинном введении натйвных и"ацетилированных РПЙП 1 холестерйна и его,.-окисленных продуктов О+я) а е е е ее т т т е щ в е щ в а в е а а е а е е вЕ в Группаживотныхи = б КонцентрацияХС в вводимомпрепарате в мгна 18 г весамыши ветаетищет в атаевт т тат 1 е щвеееетете Контроль Нативные ЛПНП Нативные ЛПНП Ацетил ЛПНП Ацетил ЛПНП Ацетйл ЛПНП Ацетил ЛПНП а е в е е е т в ет 01590,07 Я,4+0,69 фу 16,2 О,94"ф 19,81,57 Яфф 2515+1,94 ф" 30,86+2,59 я я 38,12+2,63 ф ф+ 18,24+0,45 201101710 1,0 2,0 0,4 1,0 1,5 2,0 КонтрольНативныеЛПНПНативныеЛПНПДцетйл ЛПНПДцетил ЛПНП Дцетил ЛПНП Ацетил ЛПНП Перекристаллизованный ХС Перекристаллизованный МС Перекристаллизованный ХС Окисленный ХС Окисленный ХС е в е а е а в е ае е е йф в в вввававеетСодержание ХС в мкг на 1 мгклеточного белка: еавивааеаЪееаа вае ееатееСХС ЭХСГруппаживотныхи6 Содержание ХС в мкг на 1 мг клеточного белка СХС ЭХС 11, 42+0, б Я19, 13+1, 74 ф 0,39+0,74 лизован лизован ф 0 25,431,17 ффф16,7311,4638,053,42 2,0 0,5 1,0 ть отличий по отчка Р ( 0,01Р( 0,002Р ( 0,001 Достоверно одна звезд две трит шению к контролю Т а блица 3 скорость эфиры леток(М+ш) 50 75 10 Составитель М.ДушкинТехред М.Моргенталтете е ев еевтеТиражкомитета пМосква, Ж- а РедакторЛ. Павлова Корректор С.Пека ет вт т е т ет Ее т т В е т Заказ 4362ВНИИПИ Государственног113035 писноерытиям при ГКНТ ССС4/5 о изобретениям 35, Раушская н и отк б., д ев тЮ еПроизводственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарин Перекристаллизовный ХСПерекристалный ХСПерекристалный ХСОкисленный ХСОкисленный ХС КонцентрацияХС в вводимомпрепарате в мгна 18 г весамыши Концентрация верапамила в среде инкубации клеток вмкМ. 19,6+0,8626,27+1,84+27,1 +1,65+33,27+1,49 ф Включение фС-олеата в эфиры холестерина в нмоль/мгклеточного белказа 6 часов инкубации 34,8+1,36 26,7+1,12 19,2+0,91 11,1+0,82 6,3+0,54