Способ определения инфекционной активности вирусов в процессе хранения

(51) 5 ИЕ ИЗОБ Т ВТОРСКО ИДЕТЕЛ ЬСТВ тельство ССС 201/04,С 1 тельство СССРМ 7/00, А 61 2,н, С,Мимс,вирусов жи - 70.ИНФЕКЦИОВ РОие инфекцигентов метоирусология. рительно гоючающий исную среду. осится к облай активностишкообразуюь использова огии. Техничести определвирусных агещих единицно в биотехн кое решение отн ния инфекционн нтов методом бл БОЕ) и может быт ологии и вирусол екци- зарамым ение - 8,0,ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(71) Всесоюзный нинститут молекулпроизводственног(56) Авторское свиМ 1317935, кл. С1983.Авторское свиМ. 1212045, кл. С1988. аучно-исследовательскии ярной биологии Научноо объединения "Вектор" А. В, Войтенко, Р.А,3 ига нко, С,Ю,Жуков и А,В,ШаФ.феннер, Б,Мак-Осле Дж, Сэмбрук, Д,Уайт, Биология вотных. Т.1. М.: Мир, 1977, с. 6 (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОННОЙ АКТИВНОСТИ ВИРУС ЦЕССЕ ХРАНЕНИЯ(57) Использование: определен онной активности вирусных а дом БОЕ, биотехнология и в Сущность изобретения; предва товят референс-препарат, вкл следуемый вирус и защит Известен способ определения инф онной активности вируса включающий жение культуры тканей исследу тогавирусом, инкубирование и нане агаровых покрытий с НЕРЕЯ, рН 7,.Я 21761801 А 1 Препарат разливают на отдельные дозы с однородным содержанием вируса в каждом объеме. Референс-препарат хранят в течение времени, при котором вирус имеет достаточную инфекционную активность с титром не менее 3 1 д БОЕ/мл. Для определения инфекционной активности исследуемого вируса, суспензию этого вируса разводят, заражают монослой культуры клеток, наносят агаровое покрытие, инкубируют и учитывают количество, и размер бляшек с последующим вычислением титра вируса. Параллельно с исследуемыми образцами определяют титр референс-препарата и сравнивают значения титров исследуемых образцов вируса со значениями титров референс-препарата, Разницу титров инфекционной активности вирусного материала определяют по формуле Тх=Тх(2) Тх(1) Трп(2)+Трп(1)+а(12 - 11), где Тх падение инфекционности исследуемого препарата за период времени (и - 11); Тх(1), Трп(1), Тх(2) и Трп(2) - экспериментальные значения инфекционности исследуемого и референс-препарата в момент времени 11 и 12 соответственно; а - линейный коэффициент. 2 табл. После инкубирования подсчитывают число и размеры бляшек.Недостатком способа является низкая точность определения инфекционной активности вируса, Точность определения инфекционной активности в данном способе зависит от многих факторов: качества питательных сред, физиологического состояния культуры клеток, температурного режима и т.д. Исключить вышеуказанные факторы при определении инфекционной активности вирусных препаратов, хранящихся в течение длительного времени, по данному способу не представляется возможным.Известна защитная среда, используемая для хранения вирусов и включающая пептон, лактозу и фосфатный буфер,Недостатком данной среды является то, что она не может быть использована для длительного хранения вирусов (более 1-2 мес),Наиболее близким способом определения инфекционной активности вируса методом Б О Е (п рототи пом) я вля ется способ, включающий заражение клеток чеГо десятикратным разведениями исследуемого препарата, После 60 минутного контакта при комнатной температуре инокулят сливают и монослой заливают полужидким агаровым покрытием, поиготовленным на среде Игла МЭМ и содержащим 0,03 / агара ООсо и 1инактивированной сыворотки крупного рогатого скота, Монослой термостатируют при температуре 37 С, Учет бляшек производится через 8 - 9 суток.Недостатком способа-прототипа является низкая точность определения инфекционной активности вируса, которая зависит от качества питательных сред, физиологического состояния культуры клеток, температурного режима, срока окраски монослоя,Целью предлагаемого технического решения является повышение точности определения инфекционной активности вируса в процессе хранения путем исключения зависимости чувствительности клеток от различных факторов; качества питательных сред, физиологического состояния самих клеток, температурного режима культивирования, сроков окраски монослоя.Указанная цель достигается следующей совокупностью существенных признаков способа, Способ включает разведение вируссодержащей суспензии, заражение вирусом монослоя культуры клеток, нанесение агарового покрытия на монослой с последующей инкубацией и учетом количества и размера бляшек. Вируссодержащую суспензию приготавливают в виде референспрепарата, включающего защитную среду и исследуемый вирусный агент, Референспрепарат разливают на отдельные дозы с высокой однородностью содержания вирусного агента в каждом объеме дозы, консервируют, например лиофилизацией, и хранят в течение времени при котором вирус имеет достаточную инфекционную активность с титром не менее 3,0 19 БОЕ/мл, После этого титрование отдельных доз референс-препарат осуществляют одновременно с титрованием исследуемых образцов вирусного материала и сравнивают значения титровисследуемых образцов со значениями титров доз референс-препарата. Определениеразницы титров инфекционной активности5 вирусного материала определяют из следующего выражения:Тх=Тх(2)-Тх(1 )-Трп(2)+Трп(1 )+а 1(12-11), (1)где: Тх - падение инфекционности исследуемого препарата за период времени 12-ц (910 БОЕ/мл);Тх(1) - экспериментальное значение инфекционности исследуемого препарата вмомент времени т 1(19 БОЕ/мл);Тх(2) - то же, в момент времени 12,15 Тп(1) - экспериментальное значениеинфекционности референс-препарата в момент времени т 1 - (19 БОЕ/мл);Трп(2) - то же, в момент времени т 2;а - линейный коэффициент инактива 20 ции референс-препарата (19 БОЕ/БОЕмл/дни, в случае, если результаты тестирования референс-препарата описываютсямоделью видау=а+ат (2), где25 у=9 числа БОЕ/мл,1 - время хранения референс-препарата;ао - исходный титр референс-препарата,30 В качестве защитной среды референспрепарата используют смесь инозита, лактозы и фосфатного буфера (МагН РО 4 12 Н 20)в растворе Хенкса при следующем количественном соотношении компонентов (вес,35;):инозит 3,0 - 10,0лактоза 2,5-7,5фосфатный буфер(йаНРО 412 Н 20) 1,03,040 раствор Хенкса остальное.Способ реализуется следующим образом. Перед осуществлением способа приготавливают референс-препарат на основе1 -ного гомогената печени морских свинок45 инфицированных, например вирусом Марбурга, Отбор печени морских свинок производят на 6 - 7 сутки после заражения, приусловии 30/,-ного падежа взятых в эксперимент животных, Печень морских свинок из 50 мельчают на гомогенизаторе Новоцепегегтуре МРИ/-302 (Польша), К 5 мл 100/,-ногогомогената прибавляют 95 мл раствора добавок: в 100 мл раствора Хенкса растворяют(2,5 - 7,5) г лактозы и (3,0 - 10,0) г инозита.55 Полученный раствор стерилизуют автоклавированием при 121 С 2 часа. Более тонкоеизмельчение полученного 5,-ного гомогената проводят на гомогенизатореМееэопцеп АС туре 853202 (фирма В, Вгав п,ФРГ) при 1500 об/мин двукратно, Послечего рН раствора доводят до 8,01 й раствором йаОН и добавляют(1,0 - 3,0) г фосфатного буфера (ча 2 НРО 4 12 Н 20). При этом рН становится 8,2. Полученный гомогенат разливают по 1 мл автоматической пипеткой 6 зоп, 1000 во флаконы объемом 10 мл. Флаконы помещают на полку сублимационной установки МР 0-0,02 (фирма Эдвардс, Англия), Замораживают в течение 5 часов до 1-40 С, Сублимируют 28 часов при отключенном охлаждении полок. Температура продукта в конце сублимации+20 С. Досушивают 30 часов при этой температуре. Вакуум в конце досушивания 90 мк бар, Развакуумирование производят напуском аргона, После лиофилизации флаконы герметично закупоривают и хранят при с=-12 С в морозильных камерах бытовых холодильников. Для оценки качества референс-препарата первое титрование проводилось после его месячного хранения и далее постепенно 1 - 2 раза в неделю в течение 1 года (всего 80 определений). Каждое определение по 3 - 4 повтора. За 6 мес хранения референс-препарата при 1=-12 С происходит его инактивация на 0,14 д БОЕ, За год падение титра составило 0,28 9 БОЕ, Следует отметить, что инфекционный вирус Марбург гомогенат печени морской свинки без защитной среды теряет свою активность в замороженном состоянии в течение 6 мес.1 - 1,5 9 БОЕ/мл, что не годится для тестирования культур клеток, В процессе выбора количественных соотношений компонентов на основе лактозы, инозита и фосфатного буфера. Наиболее интересные данные получены на образцах 1 - 6, Для сравнения использовалась известная защитная среда (образец 7) на основе пептона, (ГОСТ 13805 - 76) лактозы и фосфатного буфера (см, таблицу 1).Из табл. 1 видно, что предлагаемая защитная среда при следующем количественном соотношении компонентов; инозит - 30 - 100 мг/л; лактоза - 25 - 75 мг/л; фосфатный буфер - 10 - 30 мг/л обеспечивает минимальное падение биоактивности референс-препарата в процессе его хранения при т=-12 С в течение 6 месчто подтверждает существенность выбранных количественных соотношений компонентов защитной среды референс-препарата,Для определения инфекционной активности исследуемого вируса, например вирус Марбург, его суспензию разводят и заражают монослой клеток чего. Инкубацию проводят в течение 1 часа при комнатной температуре, после чего монослой заливают полужидким агаровым покрытием и помещают в термостате на 8 - 9 суток при 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 температуре 37 С. После чего окрашивают монослой клеток раствором генцианвиолета (0,1 раствор в 20 ф-ном этиловом спирте) и подсчитывают негативные колонии. Параллельно с исследуемыми образцами вируса в каждый их день титрования определяют титр референс-препарата по 3 - 4 повторам и сравнивают значения титров исследуемых образцов вируса со значениями титров доз референс-препарата. Разницу титров инфекционной активности вирусного материала определяют из следующего выражения:Тх=Тх(2) - Тх(1) - Трп(2)+Трп(1)+д 1(т 2 11) (расшифровка условных обозначений приведена выше по тексту).По разнице титров инфекционной активности исследуемого вирусного материала и референс-препарата в разные моменты времени судят о падении инфекционной активности исследуемого препарата за определенный период времени (в 9 БОЕ/мл),В табл. 2 приведены данные по определению инфекционной активности вируса Марбург методом БОЕ, Расчеты проводились по формуле (1),Значение биоактивности препарата в каждом примере определялось как среднее из трех независимых определений. осуществленных в одно и то же время. При обработке статистических данных среднеквадратично отклонение составляет;- для исследуемых препаратов 3=0,15 - для референс-препарата 3=0,1 Технический эффект от использования предлагаемого способа состоит в более кор ректном сравнении биоактивности препаратов, титрованных в разное время с учетом чувствительности серий культур клеток.Повышается точность определения инфекционной активности (не менее чем в 2 раза) за счет уменьшения доверительного интервала в 2 раза. При обработке статисических данных дисперсия составляет;- с использованием референс-препарата Я =0,023- без использования референс-препарата Я =0,048Формула изобретения Способ определения инфекционной активности вирусов в процессе хранения методом бляшкообразующих единиц, включающий разведение вируссодержащей суспензии. заражениемонослоя культуры клеток, нанесение агарового покрытия, инкубацию, учет хол,;чества и размера бляшек с последующим вычислением титра вируса, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности способа, вируссодержащую суспензию готовят в виде референс-препарата с защитной сре1761801 Таблица 1 Данные по выбору количественных соотношений компонентов защитной среды дой, представляющей собой смесь инозита, лактозы и фосфатного буфера в растворе Хенкса, при следующем соотношении компонентов, мас.:5 Инозит 3 - 10 Лактоза 2,5-7,5 фосфатный буфер 1,0 - 3,0 Раствор Хенкса Остальное, заражение монослоя клеток производят 10 дозами с однородным содержанием вируса, хранившимися в течение времени, при котором вирус сохраняет активности не менее 3,0 ц БОЕ/мл титрование доз референспрепарата осуществляют одновременно с 15 титрованием исследуемых образцов, а вычисление титра вируса и роводят по формулеТх=Тх(2)-Тх(1)-Трп(2)+Трп(1)+а 1(т 2-11), где Тх - падение инфекционности исследуемого препарата за период времени (т-т);Тх(1) - экспериментальное значение инфекционности исследуемого препарат в момент времени т 1;Тх(2) - то же в момент времени 1 г;Трп(1) - экспериментальное значение инфекционности референс-препарата в момент времени т;Трп(2) - то же в момент времени т 2;а 1 - линейный коэффициент инактивации референс-препарата.1761801 10 Таблица 2 Примеры по определению инфекционной активности вируса варбург (10 БОЕ/мл) в процессе хранения(2) Приме чание Значе онной ри ер 180 дней 0 дней БОЕ/мл 13 1,6 0 95,0 5,0; 51 4,0; 4,2; 4,3 и м е ч а н и е. Доверительный интервал 954 Составитель Ю.Мистюринедактор В,Трубченко Техред М,Моргентал ектор Л,Лук каз 3235 Тираж ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 роизводственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул,Гагарина, 1 исслед на мом ния Тх (10 БО е инфекци ктивности препарата нт молуче (1) /мл) Значение инфекционной активности исследуемого препарата через определенный период хранения Тх(2) (1 а БОЕ/мл) Падениеинфекционнойактивноти Тх(1Тх(2)= о 0029 1,4 0,4 0,011 2,7 0,3 0,027 1,1 0,4 Без учета референс-прпарата(прототип) Данныепо рефервнс"прларату С учетом референс препарата (пред ложенный способ)