Способ получения амидного соединения

)5 С 12 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТПРИ ГКНТ СССР ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ К ПАТЕНТ айся и) 1ио Кабуси сики Кайс , Есиаки С Фудзивара о, Ясута- Тосиаки 17918/81,38118/81,ОГО СОИЯ АМИД Изобретение относится к сп ратации нитрильного соединени ствием нитрилазы, вырабат микроорганизмами для превращ рильного соединения в соответ амидное соединение.:.Цель изобретения - повышен целевого продукта.П р и м е р 1, Для реализаци используют следующие микрос СогупеЬастеги(п зр. ГЕ(М СогуОеЬасСег(1 и зр, РЕЕМ 960, й ЕЕВМ ВР, Мсгососсоз зр. С Васегс(1(п зр. СВЯ 496,74, Вгеч зр, СВЯ 717,73, Васз зр, СВЯСмесь (рН 7,2), включающу 16, пептон 0,5 О, экстракт дрож солодовый экстракт О,ЗО(, и сульф особу гия под деываемения н(21) 4015504/13(71) Нитто Кагаку КоМицубиси Район Каб(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕЕДИНЕНИЯ итствующее ие выходаи способа рган измы:В Р, асагда зр. ВЯ,74, Ьастег игп 494.74;ю глюкозу жей 0,3%, ат железа(57) Изобретение относится к способам гидратации нитрильного соединения под действием нитрилазы, вырабатываемой микроорганизмами для превращения нитрильного соединения в соответствующее амидное соединение, Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта, Для этого нитрильное соединение подвергают воздействию штаммов микроорганизмов СогупеЬас 1 егогп зр. РЕЯМ ВР, или СогупеЬассегогп зр, АТЕЯМ ВР, или Косагда зр, =ЕЙМ ВР, или Мсгососсцз зр, СЯЯ.74, или ВгечЬастегит зр, СВЯ,73, Васцз зр, СВЯ.74, или ВастегсОгп зр. СВЯ.74. 7 табл,7 гидрат 0,05%, помещают в 500 мл колбу Эрленмейера. После стерилизации в смесь вводят штамм й(СогупеЬастегигп) и культивируют его в течение 2 дней при температуре ЗООС. Затем культивируемые клетки собирают центрифуги рова нием, промывают 0,05 М фосфатным буфером (рН 7,7) и получают промытые клетки, Эти клетки диспергируют в 0,05 М фосфатном буфере и получают суспензию клеток с концентрацией 17,3 г сухих клеток/литр. Суспензию клеток оставляют при температуре 0 С в темном месте на 3-4 дня.Клетки, стоящие в темноте, облучают при температуре 0 С в течение 1 ч светом с энергией 5,7 мкэ/г клеток сек., используя лампу дневного света. 100 мл суспензии клеток, стоящих в темноте (или на свету),трижды в темноте пропускают через фран- при температуре 0 С и затем определяютцузский пресс при давлении 1300 кг/см: отношение остаточной активности,2для разрушения клеток, получают 90 мл рас- Результаты представлены в табл. 3, гдетворе, содержащего разрушенные клетки, количество АА, полученное эа 10 мин прикоторый далее называют раствором разру немедленном использовании после облучешенных клеток. 50 мл раствора разрушен- ния, обозначают как 100, а отношение осных клеток центрифугируют со скоростью таточной активности - сравнительной15000 об/мин, используя высокоскорост- величиной,ную центрифугу, и получают 45 мл жидкого . П р и м е р 4. 5 мл каждого из жидкихэкстракта, из которого выделяют остаток 10 экстрактов из клеток, стоящих в темноте,клеток. В соответствии с обычным сйособом - полученных по примеру 1, помещают в 50 млиз жидкого экстракта удаляют фракции нук- стальные сосуды и подвергают облучениюлеиновой кислоты и сульфата аммония и: светом с длиной волны 300-400 нм в тече, получают 15 мл сырого раствора фермента,ние 3 мин, исйользуя лампу ультрафиолетокоторыйудаляютспомощьюдиализаипри вого света, причем световую энергиюнадлежащийфракции, полученной 50-60- регулируют с использованием фильтров сным насыщением сульфата аммония. Все различнойоптическойплощадью,помещенвышеописанные операции быстро осущест- ных в верхйей части сосудов. В результатевляют в комнате с низкой температурой "получаютнесколько образцов жидкого экс 4 С, при интенсивности светового облуче тракта с различным количеством световойния 0,02 мкВ/м с или меньше,-за исключе- энергиии определяют скорость реакции,ниемособооговоренныхслучаев,Затем 0,2Влияние общего количества световоймл суспензии клеток, или раствора разру- . энергии на скорость реакции выражают какшенных клеток, или жидкого экстракта, или отношение к 1, что представляет собой отсырого раствора фермента и 4,8 мл 0.05 М 25 носительную величину, выражающую скофосфатного буфера (рН 7,7) смешйвают ирость реакции в случае, когдазатем 5 мл 0,05 М фосфатного буфера (рНиспользованйый жидкйй экстракт не пол 7,7), содержащего 5 мас.ф 6 акрилонитрила, учает светового облучения.добавляют в этусмесь. Смесь вводят в реак- . В табл. 4 показана зависимость скороцию при температуре ОС. После заверше сти реакции от общего количества световой.ния реакции полученный акриламидэнергии,подаергают количественному анализу с помощью газовой хроматографии для опреде- . П р й м е р 5, 5 мл каждого из жидкихления скорости реакции. Для 35 экстрактов клеток, стоящих в темноте, полосуществления реакции используют свето- ученных по примеру 1, помещают в стальнепроницаемые реакционные трубы с чер- ные сосуды емкостью по 50 мл и подвергаютными полосками, Скорость образования .облучению светОм с использованием лампыакриламида (далее АА) представлена через дкевнога света; примененной в примере 1,колйчество АА, полученное за 10 мин, 40 причем часть света с длиной волны 430 нмСравнительные данные по скорости ре- отводят при помощи цветных стеклянныхакции для каждого из описанных источни- фильтров, каждый реактор имеет одинако:. ков нитрилазы представлены в табл; 1.: вое оптическое окно. расположенное в верПример 2. Клетки,стоящиевтемноте, хней части реактора, а время облучения. раствор клеток, стоящих в темноте, жидкий 45 разноедля каждого образца. Скорость реакэкстракт и сырой раствор фермента, приго- ции измеряют, как в примере 1 для каждоготоаленные из указанных клеток, получают образца, получившего различное количесттак по йримеру 1. Каждый препарат подвер- . во световой энергии,гают облучению светом в течение 10 мин, Влияние. общего количества световойиспользуя лампу дневного света, описан энергии на скорость реакции выражают ченую в примере 1, и определяют количество рзэ отношение к 1, за которую принимаютАА, полученное за 10 мин, - ." " .относительйую величину, выражающую ско-.Втабл.2 приведены результатысравне- рость реакции в случае, когда используют:. ния количества АА, полученного за 10 минс жидкий экстракт, не подвергавшийся облу-.количеством АА, полученным в случае отсут чению, что показайо в табл, 5.ствия облучения указанных веществ, П р и м е р 6. Жидкие экстракты, пригоП р и м е р 3, Каждый "из препаратов: товленные по примеру 1 из клеток, стоящихоблученные светом клетки, жидкий экстракт в темноте, разныхклассов бактерий. а имени сырой раствор фермента, полученные в но ВасИЬз(СВ 3494), Вастегбат(СВЯ),примере 2, выдерживают в темном месте Мсгососсоз (СВ 3-497), ВгеИЬастегоп1757473 Отношение скорости реакции облучен- ного экстракта к скорости реакции необлученного экстракта приведено в табл. 7,ф о рмул а изобретения Способ получения амидного соединения микробиологической трансформацией нитрильного соединения содержимым разрушенных клеток микроорганизма, или внутриклеточного вещества, от л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, в качестве микроорганизма используют - штамм СогупеЬас 1 ег 1 цгп зр РЕЯМ ВР, или СогупеЬастег 1 цщ зр, АТЕЯМ ВР, или ЙасагсПа зр ГЕВМ ВР, или М 1 сгососсцз зр, СВЯ.74, или Вгеч 1 Ьас 1 ег 1 цт зр СВЗ,73, Вас 111 цз зр СВЯ 494.74, или ВастегЫ цгп зр СВЯ.74, которые во время трансформации и/или до нее обрабатывают светом с энергией по крайней мере 10 мкэ/г микробных клеток. том, как в примере 1, Скорости реакцииизмеряют как в случае облученных, так и вслучае не облученных экстрактов.Скорость реакции для облученных экстрактов выражают как отношение к 1, которая выражала скорость реакции длянеоблученных экстрактов, что представлено в табл. 6.П р и м е р 7, Используют жидкий экстракт из штамма йклеток, стоящих в 10темноте, полученных как в примере 1, которые облучают светом как в примере 2, реакционные растворы готовят по рецептуре,представленной в табл. 7. Реакцию проводят при 0 С в темном месте, Скорость реакции для каждого вещества, приведенного втабл. 7, определяют, измерив количествоизрасходованного исходного нитрила илисоответствующее количество полученногоамида, используя газовую хроматографию 20или эффективную жидкостную хроматографию,Таблица 1 Вещество, используемое при определении активностиВид клеток Клетки "Раствор разрушенных клетокЖидкий экстрактСырой раствор ферментаКлеткиРаствор разрушенных клетокЖидкий экст акт 0,017 0;017 0,011 0,015 0,863 . 0,871 0,687 Таблица 2 Клетки стоящие в темноте Клетки, стоящие на свету Сравнительный пример. Количество АА, полученное за 10 мин,оизводственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 Заказ 3103 Тираж - " Подписное ВНИИПИ Государственного комитета поизобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5