Способ оценки осмотической резистентности лейкоцитов

(9) . - ( А 01 М 33/ ЕЛЬСТВУ едиКО ицине, огии, и альной тся покой реГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБ АВТОРСКОМУ СВИ(71) Челябинский государственныйцинский институт(56) Авторское свидетельство СССР(57) Изобретение относится к меточнее к иммунологии и гематолпредназначено для оценки функциоактивности лейкоцитов. Целью являвышение точности оценки осмотиче Изобретение относится к медицине, точнее к иммунологии и гематологии, и предназначено для оценки функциональной активности лейкоцитов,Цельиэобретеню-повышение тоессти способа.Способ осуществляют следующим образом.Выделяют на двойном градиенте плотности чистую популяцию лейкоцитов: берут плазму, обогащенную лейкоцитами в концентрации 10 клеток в 1 мл, из отстоявшейся в течение 45-60 мин при 370 С веноэной гепариниэированной крови, смешанной с половиной объема 6 (вес - объем) декстрана 75, супернатант наслаивают на двойной градиент фиколлверографина (1,093-1,078) ицентрифугируютвтечение 30 мин при 4 С, 1500 об/мин. Затем нижний слой клеток,зистентности лейкоцитов. Для этого выделяют на двойном градиенте плотности фиколлаеерографина чистую популяцию лейкоцитов, которую инкубируют с гипотоническим 0,4 - .0,5 ь-ным раствором хлорида натрия, затем с помощью гемоцитометра регистрируют количество уцелевших клеток (через 14, 30, 45 мин, например). По изменению полученных показателей в сравнении с аналогичными показателями у доноров (норма) судят о снижении или повышении осмотической реэистентности лейкоцитов. Предлагаемый способ позволяет повысить объективность результатов за счет замены визуальной микроскопической оценки на объективную оценку с помощью гемоцитометра. состоящий на 75 - 80 из нейтрофилов, собирают и дважды отмывают в среде 199 (1500 об/мин, 4 С, 3 мин), ресуспендируют в конечной концентрации (1 х 10 ) кл/мл, клетки со средой 199 в количестве 32 мкл помещают в 10 мл физиологического раствора и 10 мл 0,4-0,50-ного раствора натрия хлорида.Оценку осмотической резистентности лейкоцитов проводят с помощью кондуктометрии, на гемоцитометре. Измерения осуществляютт на гемоцитометре через 1,15,30, 45 мин в опыте (в гипотоническом растворе) исразу - в контроле (в физиологическом растворе), регистрируют количество осмотически устойчивых клеток ф). По изменениям осмотической реэистентности исследуемого образца относительно контроля и в срав 1675768нении с показателями осмотической реэистентности у доноров норма) судят о скиже- НИИ ОСМОТИЧЕСКОХ РРЗИС 1 НТНОСТИ ИЛИ повцшении ее,Учет осуществляют с помощьгемоцитометра Лаборскель-Анж изат О фирма Меди кор).Условия измерения; диаметр капилляр;100 мкм, ток, применяемый для измерения 100 МКА, пороги дискрими ации для физио логического раствора 2,5 - 7,5 В, для гипотонического 4,3-5,1 Б (двя доноров). Выбор напряжения дискриминации для под:чет осмотически устойчивых к еток зависит от результатов предварительной регистрации по монитору импульсов, составляющих бо лее 60 а/а от длины ординатц,Кроме определени соби венно осмоти. ческой реаистентности, предлагаемый способ позволяет регистрировать кривую распределения клеток в зависимости от диаметра, максимальный диаметр и обьем, до которого увеличиваатс клетки перед разрушением а также количество соответствующих клеток): по монитору на оси абсцисс регистрируют номер канала, в пике кривой распределения, стносящегося к наибольшему количеству клеток данного диаметра, в гипотоническом растворе максимальный диаметр, до которого увеличиваются клетки, реглстрируют через 1 мин после помещения клеток в гипотонический раствор, Режим измерения - ре;ким диффеоенциальной дискриминации. Регистрация максимального диаметра, до котс рого увеличиваются клетки перед разрушением, дает возможность оценить степень эластичности мембранц клеток, которая, наряду с Осмотической резлстентностью, имеет большое значение в диагностике мембранных нарушенлй.Расчет диаметра клеток производят по формуле ., К С 1 ,ьз где К - коэффициент измерительной рубки 8,619 10 з);Сп - номер канала;-4О - величина измеряемого тока 110 А). Расчет обвема клеток г роводя- пс формуле.КСп1 У О 1 г п г .1. а где а - коэффициент формы частиц 1,1 - длягранулоцитов примерно равен 1,5.Определяли коэффицлент набуханияклеток по формуле: О Оп 2 30 35 10 4 О 50 п: и = - 100Вгде А - средний диаметр клеток в изотоническом растворе; В - средний диаметр клеток в гипотоническОм растворе.Значение коэффициента набухания меньше 84,5537 а СвидетельствУют о повышении эластич;ности мембраны, значение этого показателя, превышающее 89,2477 а,свидеельствуют О снижении ее,Средний диаметр клеток В физиолОгическом растворе контроль) составляет12,5+0,599 м км; с Оедн ий обьем1022,1351+ 146,0206 мкм,Средний диаметр, до кОтооого клетки набухают в гипотоническом растворе14,384+.0,3 мкм; средний Обьем1557,5392+ 9,3462 мкм,П р и м е р 1, Донор А, Проводили исследование осмотической резистентностилейкоцитов грзнулоцитов) в соответствии спредлагземцм способом. Брали плазму,обогащенную лейкоцитами в концентрации10 кл/мл из отстоявшейся в течении 45 минпри температуре 37 С Венозной гепаринизироВзннпй крови, смешанной с полОВиной Обье";з 6;ь вес/обьем) декстрана 75,супернзтзнт наслаивали нз двойной Градиент фиколлверо рзфина 1,093-1,078) ицентрифугировзли вечение ЗО мин при 4 Си 500 об/мин. Нижний слой кле-ок, содержащий Грзнулоциты, собирали и дважды Отмы вал и В с реде 199,1500 об/ми н, 4 С,3 мин), ресуспэндировали в конечной концентрации 10 клеток в мл, Клетки со средой7199 в количестве 32 мкл помещали в 10 млфизиологического РаствоРа и в 10 мл 0,45 а/а-ногораствора натрия хлорида. Измерение проводили на гемоцитометре ЛзборскельАнализатор сразу, через 1, 15, 30, 45 мин.Диаметр капилляра 100 мкм при силе тока 100 мкд, Г 1 орог,".,Искриминзции дляфизиологического раствора 2,5 - 7,5 В,для гипотонического 4,3-5,1 Б. Получилисоответственно через 5 Зд, 45 мин значения осмотической резистентности лейко 78 21 а, 58 74 а,45 13 а/Полученные покззз 1 ели свидетельствуот о нормальной осмотической резистентности лейкоцитов донора А.Одновременно с регистрацией количества клеток реистрировали номер канала(впике кривой распределения); относяыийся кнаибольшему количеству клеток данного диаметра, Г 1 о формулам= О 666825 /- . -)К "С1675768 Составитель Ь,МануйловРедактор М, Бланар Техред М,Моргентал Корректор О. Кундрик Заказ 2998 Тираж 388 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул, Гагарина, 101 и Ч 0,156250 апроизводили расчет среднео диаметра клеток и объема в физиологическом и гипотоническом растворах. По формуле 5и = - 100АВопределили коэффициент набухания.Средний диаметр клеток, до которогоони увеличивались в гипотоническом растворе составил 14,5395 мкм, средний объем1606,2123 мкм; в физиологическом раствоз,ре средний диаметр 12,6955, объем1022,1351 мкмз" Коэффициент набухания86,014 7 ь. 15Полученные данные свидетельствуют онормальных размерах и эластичности мембрань. лейкоцитов у данного донора.П р и м е р 2, Проводили определениеодного и того же образца крови донора с 20различными исследованиями в соответствии с предлагаемым и известным способами.Из представленных результатов видно,что колебания данных в предлагаемом способе намного меньше, чем в известном, чтотакже свидетельствует о высоой точностии объективности предлагаемого способа.Проведенные испытания предлагаемого способа подтвердили его преимущества 30перед известными способами оценки осмотической резистентности лейкоцитов, заключающиеся в повышении обьективности результатов, точности - за счет замены визуально микроског дческой оценки на обьективную гемоцитометрию Кроме оценки осмотичесой резистентности лейкоцитов, способ позволяет определять и степень набухания уцелевших клеток, регистрировать максимальный диаметр клеток, до которого они набухают перед разрушением, т.е. позволяют получить более полную информацию о функциональной активности лейкоцитов. Замена трудоемкой, утомительной визуальной микроскопии не только повышает объективность и, следовательно, точность получаемых результатов, но значительно улучшает условия работы исследователя,Формула изобретения Способ оценки осмотической резистентности лейкоцитов путем инкубации с раствором хлорида натрия клеток периферической крови с последующим учетом реакции, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности способа, из периферической крови выделяют чистую популяцию лейкоцитов на двойном градиенте плотности и инкубируют с 0,4-0,5-ным раствором натрия хлорида, а учет реакции ведут по количеству неразрушенных клеток с помощью гемг.цитометра.